【分享帖】秀出你的western转膜条件 - 经验共享

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标题:【分享帖】秀出你的western转膜条件

mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

版主，您好，我提个小的建议，是不是将转膜液的配制（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度）稍提一下会更好啊，因为我觉得其实转膜液的成份还是比较重要的。

KGZ564[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对这个方向不大熟悉，但我想应该包括下列几个方面，请战友们费心了，谢谢。

蛋白来源：
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：
WB用膜类型、孔径：
转膜方式（恒压、恒流）：
转膜时间：
转膜设备:
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源：组织
蛋白名称（可保密）
蛋白分子量：42KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜（0.22）
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：60-90 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

langlang[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顶一下。

我的目的蛋白是 55kd

1.5mA/cm? 1.5h

出现丢带

pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源：E.Coli BL21
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：4kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压15v
转膜时间：O/N
转膜设备: Bio-Rad Mini 湿转
转膜液的配制：for 1 L transfer buffer: 200ml Methanol,14.4g Glycine, 3.03g Trizma-base

用了Trcine-gel SDS Page，效果不错

mickeylin[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源：肾脏
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：23kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压20v
转膜时间：35mins
转膜设备: Bio-Rad 半干

PCR[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源：来自MDCK增殖的流感病毒裂解物
蛋白名称（可保密）：PB1
蛋白分子量： 96kd （注意，10% SDS-PAGE，冰上电泳。用预染marker观察100kd的条带跑到胶的正中间位置时，才开始转膜，否则转膜效率降低）
WB用膜类型、孔径： NC膜， 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：恒压，100V
转膜时间： 2 hours
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间，准备一个冰盒，将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）： 2.9g甘氨酸，5.8gtris,0.37gSDS，200ml甲醇

WB做不好的童鞋，可以参考此文： cuturl('http://www.360doc.com/content/11/0623/19/5430276_129105136.shtml')

xue258[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源： RAW
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：235kd
WB用膜类型、孔径： NC膜， 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：恒压，100V-110V
转膜时间： 30min-1.5h
转膜设备: Bio-Rad mini box, cold room
转膜液的配制：

【5x Running Buffer】

2 L

5 L

Tris

30 g

75 g

Glycine

144 g

360 g

SDS

10 g

25 g

xue258[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

For 1000mL 1x Running Buffer: Add200mL 5x Running Buffer into 800mL DDW.

【10x Transfer Buffer】

1 L

2 L

5 L

Tris

30 g

60 g

150 g

Glycine

144 g

288 g

720 g
Add 200mL methanol/1000mL 1x Transfer Buffer before use (use H2O at 4°C);
Add 0.2% SDS (20mL of 10% SDS/1000mL 1x Transfer Buffer) for larger Proteins over 120kD.
For 2000mL 1x Transfer Buffer: 1400mL DDW + 400 mL Methanol + 200mL 10x Transfer Stock.

附件

2013-5-16 17:30

34166995.jpg (5.02 KB)

vera+[使用道具]
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发表于 2013-5-16 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白来源：肾脏
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：9kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压20v
转膜时间：30mins
转膜设备: Bio-Rad 半干

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