【求助】FITC标记蛋白

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标题:【求助】FITC标记蛋白

ii077345[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，我想用FITC标记两种小肽A和B，A分子量：约3785Da，B分子量：约3108Da，发现两条多肽链中的精氨酸、赖氨酸个数分别是6个和4个，我想反应时让FITC过量一些，使游离的氨基都带上FITC，这样A和B的分子量可能就变成5900Da（加上第一个氨基酸上的氨基，共7个游离的氨基）左右和4700Da左右。我的问题主要有以下几方面：
1：反应完后选择哪种方法除去FITC？过凝胶柱？选择哪种洗脱液？FITC会不会附着在柱子上洗脱不下来？
透析？这种方法样品损失大不大？样品量本来就不多，1mg左右。
超滤？用3000Da的超滤管会损失多少样品？
2：多肽被标记上FITC后活性会不会减弱或丧失？担心这个问题！
实验做不下去了，求好心人帮忙解答一下吧。感激涕零啊，谢谢啦！

summerxx[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实我刚好也正在做这个实验，只是我标记的是蛋白，用的是sigma的F-7250.上面也是说要用G50做纯化，我们一开始也是这么做的，结果就是蛋白浓度变低。后来，我们直接用透析袋，感觉效果也差不多。
后面一个问题我感觉应该不会丧失，至少我的没丧失活性，他的原理只是在碱性AA的R基上连一个FITC分子。
如果你需要的话，我可以给你那个down下来的protocol。你给个邮箱吧。if you need。
希望可以帮到你。

ii077345[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-5-17 11:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实我刚好也正在做这个实验，只是我标记的是蛋白，用的是sigma的F-7250.上面也是说要用G50做纯化，我们一开始也是这么做的，结果就是蛋白浓度变低。后来，我们直接用透析袋，感觉效果也差不多。
后面一个问题我感觉应该不会丧 ...

谢谢你的回复，我用的FITC也是sigma的F-7250，说明书我也有。你们用透析袋对蛋白的稀释厉害吗？“感觉效果也差不多”是什么意思？是效果比过G-25好还是和过G-25效果差不多？
你标记的是蛋白，我的是小肽，氨基酸序列里面有多个游离的氨基的话，FITC会不会都和游离的氨基反应。我怕连上FITC后对其空间位阻有影响！

summerxx[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

效果差不多，因为我没做空间构象，只需要纯化蛋白后与细胞共培养，做endocytosis，所以只要是除去fitc就可以了。稀释情况大约是稀释了2倍，原来1ml的蛋白，后来收的时候1.8ml。测得浓度比G-25要高，偷袭了48h，每8h换了一次冰pbs。我之前也怕做错，目的蛋白也很宝贵。然后我就先买了sigma的zymosan做的FITC预实验，这个之前有人做过，然后也不贵，300-400多，后来感觉稳定了才做的目标蛋白，我想你也可以找些其他的做做预实验，然后在做实验

ii077345[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-5-17 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

效果差不多，因为我没做空间构象，只需要纯化蛋白后与细胞共培养，做endocytosis，所以只要是除去fitc就可以了。稀释情况大约是稀释了2倍，原来1ml的蛋白，后来收的时候1.8ml。测得浓度比G-25要高，偷袭了48h，每8h换了一次冰pbs。 ...

我还想请教你个问题：你透析用的PBS的浓度和pH是多少？谢谢啦！

箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pH是7.4,1*的PBS
8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4

jujuba[使用道具]
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发表于 2013-5-17 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

额......标记单分子的FITC在末端不就完了

ii077345[使用道具]
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