蛋白质与蛋白组学

既然这样，无果我不封闭，直接加一抗会是什么结果？TBS配置后有两年了，一直在4度置放，会对western结果有影响吗？

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建议不要使用了。我们最初做wb时用的就是在4度保藏了2年的TBS，结果封闭效果很差。后来从新配了，背景变得很好。

请问：“把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！”，如何推开？？？与目的蛋白结合的力量？？中间隔着封闭蛋白，抗体能不能找到目的蛋白还是个问题吧？ 那又是如何推开的呢？？

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哈哈，推开只是一种比喻，至于具体如何推开就和抗体和目的蛋白的相互作用强度有关了，比如氢键，共价键，范德华力，还有空间位阻等等。这里的推开用取代或许更准确一点。而能不能找到目的蛋白，这就是一个碰撞几率的问题，按理说，这个几率在这些实验上不成问题才对。这个问题看来是很细化。

你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合

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说句实话，我以前一直是这么理解的，我觉得也不尽然就是这么回事。因为封闭不好的话，常常出现的情况是杂带显色，而不是没有蛋白条带的空白膜上显色！我现在倒更倾向于认为封闭可能是利用蛋白质之间的非特异性的相互作用（次级键的作用）而将能潜在结合抗体的部位占据。如果有人可以做一个极端的实验，利用BSA的抗体做Western，看看封闭以后是不是整个膜都显色可能会有一个比较直观的结果，呵呵。