小中大蛋白从胶上转移到膜上之后，通过skykiller所说的疏水作用、静电、范德华力等非共价键、共价键及离子键与膜结合，不同的膜结合方式也不一样。NC膜是是通过非共价键结合；重氮化膜通过共价键结合；阳离子膜是通过离子键结合；PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质的最佳用膜，呈均一控制的孔结构，具有极强的吸附生物分子的能力。如skykiller说的，封闭液的成分、浓度、pH值、盐浓度、表面活性剂及封闭时间等要素对WB的结果都有很大影响。但是skykiller所提出的吸附-洗脱假说并不适合用来解释封闭作用。封闭，顾名思义，就等于是在表面铺一层物质，来阻断那些非特异性的结合，而并不是一个洗脱的过程。免疫组化的封闭其原理是一样的，如果封闭是一个洗脱的过程的话，那免疫组化是几个微米的组织切片，那么厚的蛋白层，怎么可能洗脱掉？怎么可能降低背景呢？洗脱只能说是在孵育完抗体之后用PBS-T/TBS-T洗，将非特异性结合的抗体洗脱下来的过程。“由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。”这句话确实也能解释封闭时间长，信号减弱的问题，但我觉得这并不是其真正原因。封闭时间对于结合在膜上的蛋白的量是没有什么实质性的影响，在强酸、强碱、变性剂等等情况下才能把蛋白洗脱下来。想想看，就算是在用stripping buffer stripping之后，蛋白都能很好的结合在膜上，更何况是封闭液了。上面说提到pH值是指封闭液的pH值，并不是转膜缓冲液的pH，转膜缓冲液pH值对蛋白结合到膜上影响很大，而PBS-T/TBS-T的pH对封闭效果及一抗结合效果影响很大。
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而对于楼上所说的“由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。” 如果说封闭时间过长，导致目标蛋白洗脱越强的话，那么striping后对同一张膜经行再次分析是不是一般会有足够大的影响导致striping没有结果？而事实上，striping还是被很多实验者应用。如果目标蛋白被洗脱了，这个striping的方法我觉得是不是就没有存在的必要了呢？
我是菜鸟一只，刚刚接触WB，做了4次。拙见请拍砖！嘎嘎~
