蛋白质与蛋白组学

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者。
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。

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"从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。"

谢谢版主的建议。我做的目的蛋白分子量分别是57kD和62kD,个人严重怀疑在转膜环节出问题，电转液配置没问题、新鲜，以前用您讲的湿转、低电流100mA、2h，PVDF膜是0.2um，做了DAB结果还不错。那现在准备转膜做回以前的条件，就是低电流100mA、2h，不过想换个0.45um的PVDF膜。那现在请教您，这个膜的选择应该没问题吧？我选择孔径大的膜会不会有渔网拦不住沙子的顾虑？hope 4 ur reply！

您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？

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个人认为：您可以去查找一些文献，有关丙酮沉淀法提取蛋白的相关文章有很多，里面有介绍的，做2D电泳很多都是用这种方法的。

个人认为：您可以去查找一些文献，有关丙酮沉淀法提取蛋白的相关文章有很多，里面有介绍的，做2D电泳很多都是用这种方法的。
谢谢您。

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很不好意思，我只是做脂肪组织的普通WB，感觉浓度测的不准、导致内参都不一致，请问您有什么意见和指导。

谢谢您，再请问，在加入丙酮之后是不是就应该把脂肪组织剪碎？用不用超声裂解？还是用破碎仪破碎？
另外，5000 g相当于多少的rpm？我们用的是Eppendoff 5810R的低温离心机。
再次感谢。

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脂类组织我没提取过，丙酮沉淀应该是用裂解液溶解后的样品，因为丙酮沉淀后样品不易溶解。离心机的g和rpm的换算跟转子的半径有关，Eppendoff 5810R的低温离心机直接按“rpm/rcf"就可以转换了

为什么在ELISA封闭时有人用BSA，有人用脱脂奶粉？用BAS和脱脂奶粉有什么不同？两者是否用相同的浓度？

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脱脂奶粉: 5%, clean backgroud, but disguises some antigens
BSA: 3%, good signal strength

蛋白类药物的空间构象与其生物活性是密切相关的，请问在制药时，都是有哪些方法来测定不同批次的药品间空间结构的变化？

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简单的办法是采用圆二色谱扫描。

终极解决方案是进行X-ray晶体衍射。小肽类可以用核磁共振。