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标题:【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴

c86v[使用道具]
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发表于 2013-5-22 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做western抽提T细胞的蛋白的时候做page看了一下条带特别少，可是别人提的就很多，这是为什么呢，方法都一样啊 ，请教一下附图 第一道是maker 第二道我的T细胞蛋白 后三道别人的癌细胞蛋白，以前没提过T细胞的蛋白不知道T细胞表达的蛋白有多少种，应该不止这几条吧
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2013-5-22 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问目的蛋白和内参蛋白分子量接近，相差10kd左右，该怎么区分呢？谢谢
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kulee[使用道具]
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发表于 2013-5-22 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我做的重组蛋白连的是HIS-tag。蛋白在18度的时候有微量的能在上清中表达，但大部分还是在沉淀中。但是自爱测活性时，上清中的蛋白液没有生物活性。请问这是什么原因造成的。当时测序了，序列是完全正确的，表达出的蛋白大小也差不多对。
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发表于 2013-5-22 20:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还想请教一个问题，做western blot时要切多宽的胶才能保证把目的条带切到呢？我检测一个90kd的蛋白，在marker70稍稍下面一点切胶，曝光后还是有好几个样品的条带被切掉了，从没切掉的条带看也是在紧紧挨着70kd边缘，这是怎么回事呢？如何避免这种情况发生？

第一次做WB时，可以把膜稍微剪的大点。因为第一次做，不能确定蛋白在哪些分子量范围内显现。如果是比目的蛋白分子量小的，可能是目的蛋白的降解。
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发表于 2013-5-22 20:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我做的重组蛋白连的是HIS-tag。蛋白在18度的时候有微量的能在上清中表达，但大部分还是在沉淀中。测上清中蛋白酶的活性时，上清中的蛋白没有生物活性。请问这是什么原因造成的。当时测序了，序列是完全正确的，表达出的蛋白大小也差不多对。谢谢

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你好，如果蛋白丰度低的话很容易失活的，温度影响很大的！
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发表于 2013-5-22 20:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，如果蛋白丰度低的话很容易失活的，温度影响很大的！

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但是这个蛋白在包涵体里面表达量还是挺高的。
另外有文献报道这个蛋白的反应温度是40-50摄氏度，所以我觉得不应该是温度使酶失活的。哎，不知道是什么原因导致蛋白失活。
我也尝试过将包涵体复性，但是摸了好多条件，还是没有活性。
不知道大家做蛋白复性都有什么好的方法？
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发表于 2013-5-22 20:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好，我请教一个蛋白复性的问题。我手头一个动物细胞表达的重组蛋白，含有二硫键，复性前单体占40%左右，采用稀释法加入氧化还原对GSH/GSSG复性，复性后单体达到80%，但是一经过浓缩透析，就又发生聚合了，单体只有40-50%，请教一下老师为什么单体又会降低？是因为氧化还原对被透析掉的原因吗？复性后蛋白质会不稳定吗？谢谢老师
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发表于 2013-5-22 20:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近在做CO-IP，用的是皮尔斯的试剂盒，想证明蛋白A和蛋白B结合，用抗体A（目的蛋白分子量48KD）拖（4度摇晃过夜），加蛋白A/G珠子，洗脱后煮5分种变性，上样跑WESTERN，用得抗体B（目的蛋白分子量子19KD）孵育膜，化学发光得出条带如下，请问：左侧为分子Marker，中间粗条带（43-55KD）处 是否为 IgG重链？下面20KD处条带是否为轻链？ 我想要的阳性条带在哪儿？ 谢谢各位了，给兄弟指条明路。
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发表于 2013-5-22 20:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问下我做蛋白表达时为什么诱导时间超过2小时，表达量就很少？还有我用Rosetta菌株表达，这种菌怎么很难裂解，超声、酶解、冻溶都试了，跑的PAGE胶一点条带都没有？
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发表于 2013-5-22 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是这个蛋白在包涵体里面表达量还是挺高的。
另外有文献报道这个蛋白的反应温度是40-50摄氏度，所以我觉得不应该是温度使酶失活的。哎，不知道是什么原因导致蛋白失活。
我也尝试过将包涵体复性，但是摸了好多条件，还是没有活性。
不知道大家做蛋白复性都有什么好的方法？

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我觉得首先你得再把上清和包涵体同时上样检测，弄清楚这个蛋白是确定在包涵体里高表达；至于蛋白复性我建议你去看一下文献报道，我们实验室用的是8M Urea 和巯基乙醇处理蛋白，这个有很多说明的。
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