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标题:【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴

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发表于 2013-5-22 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问目的蛋白和内参蛋白分子量接近，相差10kd左右，该怎么区分呢？谢谢

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建议最好换内参。如果不换可以洗膜后孵育目的蛋白一抗。
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发表于 2013-5-22 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请问下我做蛋白表达时为什么诱导时间超过2小时，表达量就很少？还有我用Rosetta菌株表达，这种菌怎么很难裂解，超声、酶解、冻溶都试了，跑的PAGE胶一点条带都没有？

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不知道你这个时间设置了几个段，是前后蛋白表达量相差很大吗？另外Rosetta菌株诱导可能会产生一些毒蛋白的，个人建议不用这种，如果其他菌株不行那没办法。你可以不经过裂解直接上样看看条带怎么样！
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发表于 2013-5-22 20:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有不知道有没有哪位前辈做过IGF2这个蛋白的western blot？它只有7.5kd，摸了几次条件，都没有把它跑出来

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分子量这么小的蛋白的确很不好做，首先您需要确定一下您的目的蛋白能在胶上跑出来，而没有跑出去。另外膜的孔径建议用小一点的，PVDF膜0.2的可以试一下。还有您需要确定下您的一抗有没有问题。
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发表于 2013-5-22 20:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。
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发表于 2013-5-22 20:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为利用红外对蛋白质的研究是很有意义的
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发表于 2013-5-22 20:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply


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发表于 2013-5-22 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得首先你得再把上清和包涵体同时上样检测，弄清楚这个蛋白是确定在包涵体里高表达；至于蛋白复性我建议你去看一下文献报道，我们实验室用的是8M Urea 和巯基乙醇处理蛋白，这个有很多说明的。

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这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性
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发表于 2013-5-22 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，我想请教您一下，最近想 做细胞转染，但是用公司提出的小提中量试剂盒提出的质粒都在100多微克每毫升，这样做转染的话要加很多的液体，这样会不会把整个体系都稀释了，这样低的浓度是不是不适用于细胞转染，怎么才能提高质粒的浓度呢，我已经重新转化过了，还是很低。

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转染时的质粒浓度最好是1ug/uL. 你可以用大提试剂盒。
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发表于 2013-5-22 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。

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BCA法测蛋白浓度的，半个小时差不多。
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-22 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性

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我觉得你的蛋白可能存在一些修饰，所以才会出现这种情景。
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