蛋白质与蛋白组学

版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply

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分离胶做成梯度胶（7~12%）就可以了

WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。

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如果蛋白降解，SDS电泳一般会出现条带模糊

我做western抽提T细胞的蛋白的时候做page看了一下条带特别少，可是别人提的就很多，这是为什么呢，方法都一样啊 ，请教一下附图 第一道是maker 第二道我的T细胞蛋白 后三道别人的癌细胞蛋白，以前没提过T细胞的蛋白不知道T细胞表达的蛋白有多少种，应该不止这几条吧

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从图上看，怀疑样品中盐浓度有点高，不知电泳过程是否也有问题？

版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply

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分离胶做成梯度胶（7~12%）就可以了

非常感谢版主您！

我现在做的是关于蛋白修饰和相互作用方面的，我想问一下有没有软件可以预测某一种蛋白质的修饰及相互作用蛋白呢？谢谢

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有的 比如cuturl('http://string-db.org/') 和 cuturl('http://expasy.org/')还有好像瑞士一个网站 都可以 不过忘记了

这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性

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复性后 蛋白的活性会有非常大的损失 没有活性也是正常的；关键还是要在复性的时候 逐步降低尿素的浓度

刚开始做蛋白，我想请教一个基础的问题，望帮助解答。
现在基因的表达一般是表达一个开放阅读框，但是对于一些蛋白表达一个完整的开放阅读框往往没有太大的必要，例如：表达一种蛋白做基因亚单位疫苗，仅仅表达具有免疫原性的一段基因会不会更好些？还有就是用原核表达的蛋白，基因太长表达的蛋白太大容易生成包涵体。因此，优化表达一段基因是非常有必要的。但是如何优化表达？小弟才疏学浅，还请赐教！

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对，蛋白表达很多时候是没有必要表达一个完整的ORF的，只需要表达出目标蛋白某些功能基团就可以。但是某些时候，一个表达不完整的蛋白其空间结构的改变可能会影响其活性。针对您的问题，个人认为，可能需要构造含有不同基因长度的载体分别进行表达，然后利用特定抗原检测其活性，确定一个最优方案。

版主好：我个人认为蛋白实验关键还在蛋白的提取上，至少蛋白提取量的多少起决定作用！请问我们怎么确保蛋白提取效率呢？即便测定了蛋白的浓度，可是又怎么说明我的提取是好坏呢？比如E.coli全蛋白的提取（取20ML的对数期E.coli混悬液，OD600+0.9；这时候我的20ML的混悬液应该提出多少的蛋白才算合格呢？），

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“蛋白实验关键还在蛋白的提取” 我非常赞成，但是 “蛋白提取量的多少起决定作用” 我不敢苟同了，个人认为用最简单的办法将目的蛋白提取出来才是上策，将所有的成分提取出来也只是增加了样品分析的复杂程度，所以提取多少并不能说明好坏。一般来说，用常用的提取液提取，不必太担心蛋白的提取效率。 如果您想知道菌液中蛋白提取的准确效率，建议做个“凯氏定氮实验”进行计算。

从图上看，怀疑样品中盐浓度有点高，不知电泳过程是否也有问题？

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细胞提出来后是用0.01m的PBS洗的，然后低速离心，弃上清，加的细胞裂解液，您说的盐浓度时PBS么？电泳过程应该没问题，实验室都是用这个方法，而且右边3个条带都是好的，感觉就像裂解不充分似的