蛋白质与蛋白组学

多谢中肯的意见。

有些其他实验结果看来有必要简单说明一下。
1.这个抗体的可靠性我们并不怀疑，因为它已经在那个famous的lab验证过并发表了文章。同时，我们拿到了抗体也做了免疫染色和以上的WB，都没有值得怀疑可靠性的地方。
2. 为什么我说这个蛋白的异常表达改变了动物行为学，因为我将-/-老鼠的表达该蛋白的基因敲除以后，出现了几乎100%的rescue的效应。所以我高度怀疑这个蛋白的异常表达才是导致-/-老鼠出现特殊表现的主要原因之一。
3. 质谱没有做出来，我当初在考虑蛋白的溶解性的问题，害怕在哪个环节蛋白被降解或者根本就不溶在ip的buffer中，目前我似乎基本排除了这个想法。但是质谱过程的不可控性，我们不清楚该蛋白究竟发生了什么变化，可能还是由于我们无法富集它到足够量。
4. 还有一点就是wt的这种蛋白在某种条件下也可以产生磷酸化和去磷酸化的变化，我尝试过这些条件，无论怎样-/-总是保持固有的形态即大出wt那么一点点。
我想求证的就是我的蛋白究竟怎么了？

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lz的性格可能属于偏急躁型的吧，不过搞科研还是潜心静气比较有帮助。还是那句话：欲速则不达。把上面的交流内容再好好体会下吧，你的回复显然比较苍白。
对于你本次回复，我做如下点评：
1，不再重复，无话可讲。
2，有些道理。把你基因敲除的wb结果show下，看看你抗体到底如何。
3，不再重复。
4，有点矛盾。你开头说该蛋白还没有病例磷酸化的报道，这里你却肯定该蛋白可以发生磷酸化。这个磷酸化是国际报道的还是你们自己认为的，如果是后者，那就又回到从前了，我就无话可说了。
对于你的求证，我还是那句话，拿出证据之前，那真的不见得是你的蛋白。

我不喜欢也不想再去过多重复了，所以希望lz讨论之前好好想想，拿出点实际的东西来，讨论才有进行下去的必要。

我用了一只比较宝贵的基因敲除的老鼠做了western，请看看我的抗体效果如何。从左至右依次是：实验组，实验组，wt，基因敲除。

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不错，有了这两个figure，1，可以说明你抗体确实不错。2，病变组里目的蛋白发生了磷酸化，这个假定已经有七成的可信度了。
恭喜你了，这个课题很有戏。
对于IP的质谱结果，有，则锦上添花，没有，也无伤大雅。
下一步最关键的工作应该就是前面我说的：构建点突变载体了，这对体内和体外实验（可以用于rescue）都是非常关键的。没事多去 NCBI 逛逛吧。

曾经做一个蛋白，发现该蛋白在实验组和对照组的表现存在分子量的区别，该蛋白是个糖基化蛋白，我们已经排除该差异源于糖基化修饰。并用碱性磷酸酶处理样本后发现实验组条带下移至对照组位置。可是仅此（run 10% SDS Page）无法证明该蛋白就是被磷酸化了。我也尝试过做IEF，无果。试图ip分离该蛋白做质谱，奇怪的是的出来结果竟然是N多种蛋白的混合物，没有我的目的蛋白！ 请问大家还有其他办法能证明该蛋白在实验组的表现就是磷酸化的表现吗？我的抗体同时可以抗出这两种蛋白，目前还没有该蛋白病理磷酸化的报道，所以也没有commercial的抗体可以购买。附上WB图一张，请大家多提意见，谢谢！

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您好，能向您请教一下，用碱性磷酸酶处理蛋白样本的详细步骤方法吗？