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标题:【讨论帖】 2D PAGE 实例分析：从样本制备到结果分析

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-5-25 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现象： 蛋白质点的丢失

分析： 2向蛋白质转移中SDS-PAGE过程中电压过高（18cm的达到或者超过400V）， 如果是ETTAN 6系列的话， 不要在最初的45分钟内超过2W/GEL 。 SDS-PAGE到底是恒流好还是恒压还是恒功率好？ 其实都可以， 不过要看样品特点和胶的浓度而定，恒流电压会慢慢增大恒20mA15%的胶到最后估计要有200V以上了，高分子区带好，低分子区太快，就会比较难看恒压建议分2段，过堆积胶前较低，进分离胶再调高，这样样品在分界线上能被压得很细。


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发表于 2013-5-25 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现象： 某些蛋白质产生一些垂直条纹

分析： 样本为鼠肝样本， 造成垂直条纹的原因是由于平衡过程中中的第一步还原的DTT量不足造成的。


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发表于 2013-5-25 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现象： 银染过程中形成的过饱和点

分析： 和上样量和染色时间有关， 比较难以控制， 除非改变染色方法，因为目前银染一般是用来做张图谱， 来看看到底能分离到多少个点。 过饱和点对于图像分析和质谱鉴定都会有比较大的影响。


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发表于 2013-5-25 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现象： 在胶的下部有一大片黑色的区域

分析： IPG buffers/SDS 形成的复合物被污染了， 因为混合时间太短，载体两性电解质没有能够完全从SDS GEL 上洗脱。


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发表于 2013-5-25 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现象： DIGE结果无法比较

分析： CY2过标记， 导致扫描出来的图像CY3和CY5明显没有可比性。 这个应该是全标记DIGE试剂的时候才有的问题， 现在所用的MINIMAL DYE因为只标记一个氨基所以一般不会有过标记的情况发生。


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发表于 2013-5-25 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


相关疾病：

头痛

不知道你在做2D的时候有没有遇到过胶条发白的情况，就是一向完了之后，胶条泡涨的情况正常，但是酸性段总是有白色的竖条纹，有时侯碱性端也有，一道一道的很整齐，第一次平衡完胶条之后就消失了，每次做完都是这个情况，难道是我上样量太大吗，我做的是7cm，3-10NL，上样量大概80ug左右，这个问题真是从我做2D那天起就困扰着我，麻烦您帮我解答一下吧，小女子在此先行谢过了！
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-5-25 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lgm 于 2013-5-25 09:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


相关疾病：

头痛

不知道你在做2D的时候有没有遇到过胶条发白的情况，就是一向完了之后，胶条泡涨的情况正常，但是酸性段总是有白色的竖条纹，有时侯碱性端也有，一道一道的很整齐，第一次平衡完胶条之后就消失了，每次做完都是这 ...

你说的如果在2D结果中相对应的位置对图谱没有明显干扰的话， 应该是你的溴芬兰， 你下次可以注意下在水化完成后聚焦开始的时候， 你的上样BUFF中含有的溴芬兰会聚焦成一条蓝线并且逐渐向酸性端移动(很多朋友一般看不到这个过程， 因为我们现在设置的程序基本都是过夜）， 最后会停在靠近酸性端的地方， 略为发白。 所以不用担心！
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-5-25 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主能不能详细解释一下这张图的原因，除了Tris问题外，还有别的原因吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-5-25 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是胶中Tris的有问题还是电泳缓冲液的问题？
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wood533 于 2013-5-25 09:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是胶中Tris的有问题还是电泳缓冲液的问题？

出现这种问题，不会是电极缓冲液中的TRIS干扰， 而是你的SDS-PAGE的BUFFER中的TRIS-HCL系统中的TRIS不纯引起的。
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