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标题:【讨论帖】 2D PAGE 实例分析:从样本制备到结果分析

changlhsyo[使用道具]
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有一张胶图请您指教一下,是不是因为上样量太高才跑的这么烂啊。我跑的是植物蛋白,4-7的24cm胶条,上了1500μg样品,考染。期盼您的指导。


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2013-5-25 10:04
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qumm1985[使用道具]
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楼主好,我也有两个图片希望指导一下。这个是今天跑的胶。17cm,PH4-7,上样量300ug,一向顺利升压,二向也没有问题。染色出来发现点是反着的,上方白色的很明显是我需要的蛋白质,但是却是白色的。其他地方一码黑。不清楚是怎么回事,希望指点。不甚感谢。我再把我跑的好的一张用来做对比,一并发上来。
今天跑的这个,是用的老以前的一瓶1X电泳缓冲液。不知道是否和这个有关。


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qumm1985[使用道具]
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这个是以前相对成功的一张,对比着大家看一下吧,希望能找出原因。多谢各位!
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avi317[使用道具]
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Tris在裂解液的时候可以添加,但在水化液的时候尽量不要添加.
而且尽量用水化液将裂解液中的Tris浓度降低.因为Tris会严重影响pH梯度.
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qumm1985[使用道具]
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楼上这位大哥你是评论的哪个战友的胶?我的?
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changlhsyo[使用道具]
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楼上战友的胶似乎是银染的, 精子蛋白一类的生殖细胞的蛋白质提取物。 你的图像形成负染一样的原因我猜测有以下的原因:

1. 首先是水, 银染的水非常重要, 和你的电极缓冲液关系不大, 背景脏的话你的DDH2O还是去离子水肯定污染了(或者是染色盆)

2. 出现反色的原因之二是显色过度, 可能在显色后会发黄, 扫描之后就显得好像是反白了一样。 xia0h战友的那张正常胶的几个大点也都有这种现象。
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qumm1985[使用道具]
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确实我跑的是精子蛋白。不知道阁下是如何一眼就能看的出来的。确实用的是银染,水是我新鲜打的去离子水。当天我还特别勤快的专门新鲜打来一桶水。染色盆我也是经过多次的洗刷,才开始染的。
显色也没有太过度,也就是刚刚出现小分子蛋白那部分的点我就终止了。下面再次附上照片,更清晰点,希望战友能指导一下,我下一步该有哪些地方需要改进。谢谢了!
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she[使用道具]
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TRIS-HCL系统中的TRIS都是用GE公司的,应该说没问题的
刚开始做没什么问题,中间跑几次6块重复的都跑成了这样,后几次也都正常了,条件都是一样的,很纳闷,一直不知原因出在哪?
还烦请楼主分析一下,谢谢!
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changlhsyo[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 she 于 2013-5-25 10:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

TRIS-HCL系统中的TRIS都是用GE公司的,应该说没问题的
刚开始做没什么问题,中间跑几次6块重复的都跑成了这样,后几次也都正常了,条件都是一样的,很纳闷,一直不知原因出在哪?
还烦请楼主分析一下,谢谢! ...

麻烦还是把你自己的图以及实验条件贴上来, 可以方便大家一起分析并且最快找出原因来(你贴的那张图是我的实验分析中的一张例图)。
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ukonptp[使用道具]
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有一张胶图请您指教一下,是不是因为上样量太高才跑的这么烂啊。我跑的是植物蛋白,4-7的24cm胶条,上了1500μg样品,考染。期盼您的指导。

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你的图没有跑开, 展现的点也不多, 所以无法判断你的是什么植物蛋白, 24cm胶条, 上样1.5mg并不算多, 你看下图是我们一个粗样本提取物上了3mg的, 18cm胶条展现的(因为上样量太大, 所以有些地方成团了)。这里粗略的分析下sangyl 战友的图谱:

1. 24cm的胶因为面积很大, 所以相对于18cm的胶展现的点有时候会相对来说比较少点, 你的蛋白质点在整个图上等电点方向和分子量方向上分布比较的均匀, 所以1向选择的4-7的胶条和2向的胶浓度是没问题的而且肯定是经过精心选择的。

2. 虽然背景不深, 但是你的点并不是很SHARP, 分离的也不好, 不知道是否有经过TCA-丙酮沉淀? 这个步骤是做植物蛋白的推荐步骤。

3. 感觉聚焦不是很足, 可能需要调整下梯度过程和总的聚焦的伏小时, 应该能得到更好的展现。


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