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标题:【讨论帖】 2D PAGE 实例分析：从样本制备到结果分析

junjie05[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的样品是经过了TCA-丙酮沉淀的，原来的上样量是800μg，点分离的还可以，但是感觉点的数量太少了，一张胶只有400个点左右，所以这次提高到了1500μg，第一向跑了69,000Vhr，看来聚焦不太够啊，您觉得这个数应该提高到多少比较合适呢？
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she[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分感谢楼主！！
我做的动物的肌肉样，感觉蛋白提取没什么问题，用的GE的设备，升压顺利，电压能升到10000v，18cmpH4-7的胶条聚焦70KVH，第二向程序2w/gel, 45min, 15w/gel 约5h,下图是其中一张出问题的图，有好几次跑6块胶是都这样，摸好条件后就没变过了，起初没出什么问题。
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发表于 2013-5-25 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的银染，上样两150ug，第二向10%的胶，感觉上部比较严重，下部似乎问题不大，一直不知问题出在哪，望楼主能帮分析一下，谢谢！
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发表于 2013-5-25 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个大家一般是怎么作的呢？
6跟胶条转移肯定要一定时间的

========================

现象： 平衡时间对于结果的影响

分析： 在IEF完成之后在向2向的转移过程中平衡非常重要， 有时候可能觉得耽误点时间没关系， 但是一次2条还好， 如果是6条的话， 可能就会不自觉的延长了平衡时间了， 下图就是不同平衡时间对2D结果的影响， 所以大家一定要严格控制好时间， 不然会对结果造成严重影响。 左图是标准时间内完成的， 右图是延长了还原5分钟， 延长了烷基化15分钟之后的后果。

我们还要注意的是1. 不烷基化会怎么样？ 会在2向上造成大量垂直拖尾
2. 在加入烷基化平衡液之前一定要沥干DTT平衡液， 不然会大为减低效力
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你能不能做个关于IEF的专版，2D-PAGE，IEF很关键，能不能举点相关的例子来作为实验参考，因为我做IEF老是遇到很多的问题，谢谢！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
IEF的特点很难说，和胶条的种类， 水化的方法， 具体的操作， 温度， 时间都有很多关系， 而且没有一个很直观的放法来判读， 虽然现在很多IEF机器都有R232外接口， 可以和电脑联线， 记录IEF的电压，电流的改变过程， 但是也没什么人用。
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
向大家求教DeStreak的使用方法?
急需详细的使用方法啊
我现在使用的时holder上样
但是又想使用DeStreak有什么办法解决啊?
具体又需要多少量了?
同时要加DTT吗?
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DeStreak试剂盒有说明书的， 你可以参考说明书一步步的做， 最好还是用上样杯， 因为我们同时还要加DTT， 而DTT的浓度过高会将DeStreak（HED）形成的二硫键打断。 而DeStreak的优点就在于它的二硫键形成的时候， 是完全不可电离的， 而DTT则是部分的保持这可电离的硫醇结构， 所以DTT的浓度过高会严重干扰DeStreak的还原效果。
因此,建议使用DeStreak (HED)时最好采取上样杯加样,提取样品时仍使用DTT,而使用DeStreak 进行IPG胶条的泡涨.这样,最终的DTT浓度稀释到了10mM以下.
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u76mp[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主帮忙看看我的这张图，是同一个样本，同样的上样量，不同的提取方法，左边是Tris-饱和酚法提的，右边是TCA/丙酮法提的，用的是11cm的胶条，ph3-10。我想问的是胶的背景很深，酸性端的蛋白聚焦没聚好，需要在什么地方做些改进，谢谢！
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flower@@[使用道具]
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发表于 2013-5-25 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：

结核

我最近在做结核的2－D电泳，胶图一直很不满意，在酸性端总有大量的纵纹，背景也很高。另我烦恼不已。请麻烦帮我分析这究竟是哪类杂质，该怎么清除啊。
我的样品制备方法是： 用10mMTris 8.0洗涤细菌5次，加入裂解液（9M 尿素 4％CHAPS 1%TritonX-100 10mM Tris 8.5 1mM PMSF 2mM EDTA 70mM DTT）超声10min 2s/4s
然后14000rpm/min 离心30min，取上清。上清不管用10％TCA-丙酮沉淀，然后用冰丙酮洗3次。还是不进行纯化，酸端背景都很明显。
13cm （PH4-7）胶条聚焦的程序是： 水化6h, 50v,6h, 500v ,1h, 1000v,1h,8000v,1h,8000v,66000vhs
一般聚焦电压只能升到6600v左右。
二向采用12.5%
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