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标题:【求助】heLa细胞mTOR 分子的western blot

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-5-28 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
bgf5说的没错，你的转膜时间可能偏短，或者仪器的问题（其实很多国产仪器的内核，它的绕线不精细，所以在相同条件下，它可能出问题；但是对一般的蛋白没影响，因为时间短，而且比较好转膜，对大蛋白的转膜效率就不同了）；所以干脆点，你就是延长转膜时间，再不行60v转膜过夜。另外，转膜液中一定要含SDS，但含量不超过0.1%；延长转膜时间的话，你可以考虑在一半的时候，更换新鲜的转膜液；转膜过程要时刻注意不能温度过高（手摸上去有点温就表明开始过热了），一定要加冰槽，并且及时更换；要设置最高电流。
至于235和289的问题，其实如果你搞清楚了，这种WB图片是如何定义分子量大小的就不奇怪，经常会出现同个蛋白分子量不同，那是因为蛋白分析软件做不到那么精确，只是相对值。何况mTOR那么大，差一点点其实表观分子量计算出来差很多。如果是个小蛋白，也许就只是差个1-2KDa。你认为能够准确定义一个蛋白的大小吗！？（针对这种SDS-PAGE的表观分子量而言）要准确定义大小只有质谱，而且那不是表观分子量。

你最好要个质粒，过表达做阳性con，但是对于这么大的蛋白，提质粒很困难
除了之外，查查文献看看有没有做mTOR表达调控的，但是我觉得估计也不是条可行的路线。那个刺激它活性升高的，你看清楚了，是EGF刺激的结果；没有EGF，你有没有bFGF，TGFa等等吧，要不看看H2O2、UV能不能激活，这些能刺激AKT，但是对下游mTOR我不是特别清楚
PS：cell signalling虽然主要做磷酸化抗体，但是它的品质并不能体现它的“专业”精神；所以。。。不好说呀。
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发表于 2013-5-28 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接作下游靶蛋白PHOSPH P70S6K, 4E-BP1
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dream2013[使用道具]
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发表于 2013-5-28 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-5-28 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
bgf5说的没错，你的转膜时间可能偏短，或者仪器的问题（其实很多国产仪器的内核，它的绕线不精细，所以在相同条件下，它可能出问题；但是对一般的蛋白没影响，因为时间短，而且比较好转膜，对大蛋白的转膜效率就不同了）；所以干脆点，你就是延 ...

非常感谢您的热心。
1.对于装置问题，我们实验室用的是BIO-RAD公司的进口装置。转膜我们是用下图中的装置，用海绵、滤纸，把胶膜做成三层夹心，放在黑白的那个夹子里面，然后在小型电泳槽中，湿法转膜。

2.对于转膜液，我们的配方是：1L转膜液中，Tris 3.03g，Glycine 14.4g，甲醇 150ml（查资料说甲醇可是膜变性带正电，有利于和蛋白的结合，所以我这次实验稍微多加了些，170ml）。您说到的SDS不知在转膜过程中具体作用什么呢？？可否再解释详细些呢？？

3.转膜时，我们把上面的装置放在冰浴里转膜。我们是恒压转膜。您说的60v转膜过夜，还要设置最大电流，这个具体要怎么操作呢？？最大电流要多少呢？？我初做WB，好多不是很明白，麻烦您再解释下，好吗？？^_^

4.我前些天已经确定了AKT的激活，现在想检测下其下游的mTOR是否也被激活。如果mTOR有条带，而phospho－mTRO没有条带那说明我的设想可能是不正确的。所以我现在是想把mTOR先作出来。

问题比较多，还希望您能帮忙解答。还有版上的达人们，如果有什么建议，还望不吝赐教啊～～


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发表于 2013-5-28 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接作下游靶蛋白PHOSPH P70S6K, 4E-BP1

===============

抗体要好多米啊
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发表于 2013-5-28 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白增加电荷，使你的蛋白容易转过去。
个人觉得你的问题关键是转膜。可以摸索一下条件，比如增加转膜时间。
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发表于 2013-5-28 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 u234 于 2013-5-28 13:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白 ...

这样啊～～谢拉。可是我查了一下，好像有人转膜时甲醇浓度20％的，而且我的175kd的marker蛋白转过去了啊…………。
我也觉得转膜是关键，很有可能我的目的蛋白没有转过去。转膜后我胶考马斯亮蓝染色之后看胶上蛋白剩余，好像大分子量蛋白和小分子量蛋白的颜色深浅差不多哎
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发表于 2013-5-28 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白增加电荷，使你的蛋白容易转过去。
个人觉得你的问题关键是转膜。可以摸索一下条件，比如增加转膜时间。

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这样啊～～谢拉。可是我查了一下，好像有人转膜时甲醇浓度20％的，而且我的175kd的marker蛋白转过去了啊…………。
我也觉得转膜是关键，很有可能我的目的蛋白没有转过去。转膜后我胶考马斯亮蓝染色之后看胶上蛋白剩余，好像大分子量蛋白和小分子量蛋白的颜色深浅差不多哎
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发表于 2013-5-28 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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转膜时甲醇浓度20％比较适用于200KD以下，建议使用10%
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 小中大

你好,我们实验室也是做的MTOR信号pathway.
mtor 和pmtor用的都是cellsigning 公司的.
效果还不错.
可能每个实验室的步骤不一样.依据我们的实验条件给你些建议.
1 转膜 300mA 恒流转,2.30小时,湿转
2 封闭 3%BSA
3 一抗和二抗均用3%BSA稀释(对于磷酸化抗体,尽量不用牛奶)
对于磷酸化的抗体,建议1:500,4度过夜(最好)
转膜液的问题,应该不会太大,应该是问题是处在一二抗上了,你也可以做S6K,我们用的也是cellsignal的,他家的磷酸化抗体还是不错的.
阳性对照的问题,建议你可以用3T3L1,这个细胞正常条件下有MTOR的表达,也可以用insulin刺激30分,收样品,可以看到激活的mTOR.
祝你好运!
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 小中大
呵呵，60v恒压是没必要设置最大电流的，因为根本跑不到那么高的温度。
littlesmile专门做这个蛋白，应该给的条件可行，建议试试；她说得很正确的地方在于，转膜对于大分子量蛋白是重要，但WB最核心的技术在转膜之后，其实更多时候出问题不是在转膜这一步，而论坛上太多人把焦点集中在转膜上，造成了一种舆论的偏差。
我在一个帖子上说过：一个抗体一个脾气，抗体的使用才是艺术。

PS：SDS对大蛋白转膜很重要，前段时间一个250KDa的大蛋白，俺一直搞不定，但拿过来的抗体在美国那边用得好好的；后来发现是俺偷懒用了semi-dry buff.，对小蛋白semi-dry buff.也可以用，但对大蛋白不行，后来补加SDS就正常了。
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