蛋白质与蛋白组学

非常感谢您的热心。
1.对于装置问题，我们实验室用的是BIO-RAD公司的进口装置。转膜我们是用下图中的装置，用海绵、滤纸，把胶膜做成三层夹心，放在黑白的那个夹子里面，然后在小型电泳槽中，湿法转膜。

2.对于转膜液，我们的配方是：1L转膜液中，Tris 3.03g，Glycine 14.4g，甲醇 150ml（查资料说甲醇可是膜变性带正电，有利于和蛋白的结合，所以我这次实验稍微多加了些，170ml）。您说到的SDS不知在转膜过程中具体作用什么呢？？可否再解释详细些呢？？

3.转膜时，我们把上面的装置放在冰浴里转膜。我们是恒压转膜。您说的60v转膜过夜，还要设置最大电流，这个具体要怎么操作呢？？最大电流要多少呢？？我初做WB，好多不是很明白，麻烦您再解释下，好吗？？^_^

4.我前些天已经确定了AKT的激活，现在想检测下其下游的mTOR是否也被激活。如果mTOR有条带，而phospho－mTRO没有条带那说明我的设想可能是不正确的。所以我现在是想把mTOR先作出来。

问题比较多，还希望您能帮忙解答。还有版上的达人们，如果有什么建议，还望不吝赐教啊～～

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SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

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谢谢 呵呵 解释的好专业。
最近在想TBS 和PBS 的问题，也搜索了下园子里的帖子，不过大家说法不一。想请教下您觉得这两种缓冲液在WB时效果有什么不同吗？？有什么情况只能用PBS或是TBS吗？？
还有，有人说在封闭的时候不要TWEEN-20，一抗二抗和洗膜时再加TWEEN－20，我们是封闭时有T的，这个会有什么大的影响吗？？

SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

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说法不准确，太绝对化。我们的marker在半干转的时候经常过头（就是颜料都跑到滤纸上了），我不懂你说的那些专业的东西，但是我当初猜测甲醇挥发快（久置的buff.可能甲醇挥发掉了转膜过头了），所以提高甲醇的浓度至25%，并没有发现影响转膜，颜料确实截留更多（转膜过头的较少）Marker更清晰了，呵呵。用你说的理论可以恰当的解释这一现象。
但是我必须指出，你后面的说法太绝对了，我们主要研究的蛋白复合体的组分从100KDa到20KDa都有，25%的甲醇没有任何影响

封闭液内不能加Tween-20纯粹胡扯蛋。我们的抗体稀释液就是封闭液，没有另加过啥咚咚，除了一抗加NaN3抑菌；Tween-20是用于消除背景的（非特异结合），用PBS不好，不好，即使用PBS最好还要补Tween-20。免疫荧光就是这么干的呀

说法不准确，太绝对化。我们的marker在半干转的时候经常过头（就是颜料都跑到滤纸上了），我不懂你说的那些专业的东西，但是我当初猜测甲醇挥发快（久置的buff.可能甲醇挥发掉了转膜过头了），所以提高甲醇的浓度至25%，并没有发现影响转膜，颜料确实截留更多（转膜过头的较少）Marker更清晰了，呵呵。用你说的理论可以恰当的解释这一现象。
但是我必须指出，你后面的说法太绝对了，我们主要研究的蛋白复合体的组分从100KDa到20KDa都有，25%的甲醇没有任何影响

封闭液内不能加Tween-20纯粹胡扯蛋。我们的抗体稀释液就是封闭液，没有另加过啥咚咚，除了一抗加NaN3抑菌；Tween-20是用于消除背景的（非特异结合），用PBS不好，不好，即使用PBS最好还要补Tween-20。免疫荧光就是这么干的呀

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呵呵 昨天又做一次western，转膜时加了0.1%SDS，其他条件不变，还是没有条带。请教了下其他人，说可能我电泳蛋白没有跑开。我是用的6％的分离胶，130v电泳3h，bio－lab的marker 10ul，可是跑到后来marker的条带完全看不到了，所以也不能判断电泳的情况，3h的时候就停止了。想问下，如果我的目的蛋白没有很好的和其他蛋白分离，有没有可能wesern检测不到条带？？谢谢