蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化

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标题:【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化

箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图7中，穿透和50mM洗杂蛋白两条带，应该是没目的条带的，由于这次图用的是大量制备时收集的样，所以有条带，因为量一多，柱子挂的不是很好（穿透），稍微改变也能洗下些蛋白（洗杂），不过以前试验图倒是没条带。
标记补齐了，大家可以看看。Ni柱使用是我多次试验无意中发现的，50mM洗杂多洗几次，可以洗的挺干净的，100mM也足够完全洗脱了。超滤管给我很大的方便。能得到纯的蛋白和水，听说盐水超滤后就不咸了。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主在证明目的蛋白有表达中菌液怎样处理后做的SDS-PAGE呢？用蛋白裂解液行吗？
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发表于 2013-6-1 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主的蛋白只过镍柱就纯化的那么好，真让人羡慕啊。离子层析、凝胶过滤层析都不需要吗？
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发表于 2013-6-1 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主在证明目的蛋白有表达中菌液怎样处理后做的SDS-PAGE呢？用蛋白裂解液行吗？

===========================================================================================================

诱导表达完毕后，取0.5-1ml菌液离心弃上清，沉淀加入200-400ul水混匀，取40ul样品加入到10ul 5*loading buffer中，沸水浴加热3-5min，取5-10ul上样SDS-PAGE。
过程中不用加任何蛋白裂解液，loading buffer起到相同作用。
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主的蛋白只过镍柱就纯化的那么好，真让人羡慕啊。离子层析、凝胶过滤层析都不需要吗？

============================================================================================

与蛋白种类，表达情况，胶种类，纯化参数，目标收率等等相关。
如果你不在乎纯化收率的话，把镍柱的条件细化等很精确，再采用分段收集多个样品的方法，一步镍柱也可以得到很纯的蛋白。
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发表于 2013-6-1 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好，我最近也是刚刚在做蛋白纯化，可纯化了好几次都没有目的带（35KD），我用的是TOYOBO公司的蛋白纯化试剂盒，载体是pet32a，纯化后出现大约20KD 的带，请问这个带是组氨酸标签的带么？
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发表于 2013-6-1 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ladyhuahua 于 2013-6-1 13:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好，我最近也是刚刚在做蛋白纯化，可纯化了好几次都没有目的带（35KD），我用的是TOYOBO公司的蛋白纯化试剂盒，载体是pet32a，纯化后出现大约20KD 的带，请问这个带是组氨酸标签的带么？ ...

条件不够，分析不详。
可能的原因：
1：PET32a表达的融合蛋白有可能断裂。
2：重组质粒构建不正确。
3：没有真正表达，20kd蛋白是杂带。

注：未插入目的基因的PET32a表达出的histag蛋白大约为22kd左右。
插入目的基因后表达的融合蛋白其histag融合段大约为14-17kd左右。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主辛苦了。顺便问一下，你的融合蛋白用的是什么标签？HIS还是GST?或是其他什么？
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2013-6-1 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主辛苦了。顺便问一下，你的融合蛋白用的是什么标签？HIS还是GST?或是其他什么？

呵呵，看帖不认真。多处都写了PET32a，是histag。
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tie8[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是开始了三个月了，从最开始的迷茫到现在稍微懂一点经历了很多，很羡慕lz的钻研精神，我的蛋白每次用Ni柱纯化的效果每次都不一样，也还没弄清原因
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