小中大我师姐也说再去摸索条件不现实,但是,就像你说的,我的第一反应也是怎么避免它出现怎么提高上清的表达量。一个是因为GST变性复性后GST本身的空间结构不能保证,也就是可能挂不住,就算GST挂住,后面的蛋白空间结构也不敢肯定。另一个原因是,没有做过包涵体变性复性,总觉得很复杂,心里很胆怯---鄙视一下自己---
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大部分人都很担心变性复性后会导致蛋白的空间结构破坏从而导致活性下降甚至没有,其实真是情况并不是我们假想的这样,在合适的条件下绝大部分重组蛋白在先变性后复性后活性的损失是可以忽略不计的。最近刚好在写毕业论文,就直接把我自己用过的变性复性protocol贴出来,欢迎大家讨论。
包涵体的溶解和复性
1、PBS buffer洗涤诱导后菌体,重悬菌体,超声波破碎。
2、4℃,12000rpm离心10分钟,弃上清。
3、用1.5ml Lysis buffer+1%Triton X-100洗涤沉淀,冰上放置10min后12000rpm离心10min去上清。
4、往沉淀中加1.5ml Lysis buffer+0.3%SKL(十二烷基肌氨酸钠),洗涤沉淀,使其缓慢溶解,室温静置30分钟至2小时。
5、4℃,12000rpm离心10分钟,取上清置于透析袋中。
6、依透析袋体积加入若干Refolding buffer稀释上清,4℃透析复性24-48h后取10μl跑胶检测,剩下的样品-20℃长期保存备用。
7、复性好的重组蛋白过GST树脂纯化即可。
Refolding buffer(TGE buffer)配方(1L):
Tris-HCL 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油 5%
DTT 0.1mM
说明下:该protocol对应50ml菌液诱导产生的蛋白,所以如果你是1L这样大量诱导的情况,请在包涵体溶解后适当稀释后再入透析袋中透析复性。当然这个条件需要你稍微摸索下,也许不需要稀释即可直接透析。