蛋白质与蛋白组学

我曾经有用过十二烷基肌氨酸钠来洗涤包涵体，但是发现目的蛋白也给洗掉以部分，而且发现包涵体后面形状和开始的不一样，所以我认为最好不加这个，我用过很多种复性缓冲液做过比较，发现20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两个缓冲液合适很多包涵体复性，有兴趣的不妨试试。最终是将pH10.5用6M HCl调到pH8.0 慢慢的调下来。

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谢谢你。你能把你的复性过程说的详细一点吗？你是同时用了20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两种缓冲液？为什么要pH10.5？而且后面还要调到8.0？是按你的目的蛋白的等电点来的吗？

我尝试了16度，IPTG0.1mm诱导，每3小时取表达产物，然后运用溶菌酶，反复冻融最后超声破菌，SDS-PAGE考染和WESTERN-BLOT后，菌发现上清一点没有目的产物，全部在沉淀里。反复试了几次后，结果一样。所以，我认为，如果是一些很顽固的包涵体，做任何诱导条件的调整都是无益的，唯一解决的办法就是换载体。

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现在换了没？

我用的是pet，也是这样，上清的目的蛋白非常少，也用低浓度IPTG，23度诱导了，还是不行，郁闷的要死~~~~~

版主啊，我之前的蛋白实在是上清表达太少了，过akta，总峰过后就基本保持基线平了，什么峰也没有，我都要疯了~~~
所以我决定就用包涵体变性复性测酶活了，但是师兄说这样测得的酶活会活性打折，很容易没有活性，是这样么？
另外，如果变性后的蛋白过柱会不会堵柱子呢，我的是1ml的镍柱，不能自己填材料的，如果用滤膜抽滤会不会防止堵呢，那么用0.22的还是0.4的滤膜呢？我只有0.4的，但是听说要用0.22的
多谢版主不吝赐教啊~~~！！！

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过akta，总峰过后就基本保持基线平了，什么峰也没有
这句话看不懂。你应该给出详细的纯化流程。缓冲液的成分等等。点击参考我的签名档提有关纯化问题。
如果肯定上清中有目标蛋白，Ni柱纯化上清是值得尝试的。

包涵体变复性后酶活性如何很难讲，但绝非很容易没有活性。除非你的酶高级结构很复杂。我认为你可以尝试。

变性后溶解的蛋白要离心、过滤、最好再超声后上柱，防止堵塞。0.22的滤膜一般滤不动的，我们通常就是用双层滤纸过滤，它的效果和0.8滤膜差不多。如果能用0.45滤膜过滤一下，更好。你的柱很小，样品量也不多，可以用0.45滤膜。