蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】GST融合蛋白纯化

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标题:【求助】GST融合蛋白纯化

IAM007[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GST标签蛋白大概27kD左右，你可以用GST的抗体做一下 western blot鉴别一下再到是不是GST标签，如果是就说明是在表达或者破菌过程出现降解。可以在破军的时候就加入EDTA，看是否是在破菌以后降解。
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得你可以改善的地方：
诱导时的温度可以降低到15度；过夜诱导；
菌的重悬液可以不加tritonX100；
破碎的功率可以降低到300W，超声4S、间歇8S，循环100次；
祝好运！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.你的蛋白在上清中表达情况看不太清，但GST空标签表达也很好，纯化时也吸附。如果你目的蛋白在上清表达很好，过柱流出也很少，但解离很少，可能目的蛋白已经沉淀在柱子上。按我的经验看，你的蛋白在上清中表达量不高。
2.应该是你的GST融合蛋白比较大，GST标签暴露不好。
3.你的破碎的时候换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠。
4.对于空标签的去除你可以考虑用其他的离子色谱法，如DEAE。
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PCR[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的你好：请问换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠，为什么呢？PH或氯化钠能使其断裂吗？
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