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标题:【求助】western背景高

abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

封闭液里建议你家千分之1的吐温试试
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jujuba[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

tween含量过低，封闭液还有tbst洗的时候tween的量不足，你是配成20%的tween然后作的么？我看到有人曾经每次做都吸取100%的纯tween，每次都吸不准，背景很高，再就是二抗浓度太高了也会有背景高的问题
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

经过反复的摸索后，还是不行。我换了一个新的抗体，解决了。我觉得应该是原来那个抗体的问题。Santa的抗体有时候确实不好做。我买的时候，试剂公司的人就说了，Santa的抗体药看运气的，他们生产出来后不做检验，直接销售。不过，Santa的确实便宜啊。以前我们买的还可以，这次可能让我碰上了。
谢谢大家的关注和帮助。 ^_^
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发表于 2013-6-4 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从图片上看,有类似气泡的区域,没有任何本底的反应.说明应该跟跟曝光的过程无关,排除ECL干扰.
同时泳道颜色均匀的略深,属于系统本底,应该于上样量没啥关系.着重看酶和抗体吧.个人不觉得会是吐温的问题.
抗体和酶重点怀疑,另外,我还会怀疑电泳液和转膜液,或者是转膜用的滤纸反复使用导致的交叉污染.
另外,显影液最好常换,夹子也要经常清洗.
我的经验是,把膜夹在自封袋中放在夹子里曝光,有助于本底降低.
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
单纯从图片上来看我觉得你可以从以下几个方面改进：
1 一抗是可以稍微在稀释，因为目的条带都是很清晰的，只是有背景而已。
2 我的经验是封闭用5%的脱脂奶粉，而一抗稀释用的是5%BSA的TBST，这样的一个好处是稀释的同时能够用BSA将奶粉没有封闭的位点封闭。
3 其实你肉眼都能看得清楚的荧光是比较强的，这样的话你曝光的时间一定要短，只要十多二十秒就可以，有时候甚至只要几秒就足够了。
4 第四张图片还是可以接受的，你可以再用同样的调件适当优化一下就应该可以做出比较漂亮的图片来的。
祝你好运了！
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近背景高的western好多呀. 呵呵. 包括我.

两点改进:

1. 牛奶可以用到20% (其实我用过30% , 疯了?, 没有, 我的膜现在就在30% 的牛奶里block着, 不信过来瞧瞧, 呵呵)

2. 继续棋盘式稀释一抗和二抗, 多少倍稀释其实无法与别人的参考, 因为大家条件都不甚相同, 最佳条件还得自己膜呀. 但,,,,, 稀释时要大胆一些, 不要2倍2倍的稀释, 可以以10倍为单位, 或以5倍为单位, 这样较快得到结果.

Good luck!. 一起努力.
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

santa的抗体还真叫人汗.......居然还能不检验就出厂，这不是明摆着有浪费大家精力和为数不多的经费的嫌疑嘛。话说，前几天师姐图便宜买了个抗体，单抗乖乖做出8个条带来，更让人 郁闷的是想要的条带没有，竟是8条清清楚楚地非特异性条带，当时就让人晕倒了。
我要是做WB背景高，排除了抗体的问题以后，会考虑到封闭液的问题，我习惯用BSA。一般在摸条件的时候，我会做不同浓度的BSA和脱脂奶粉，就我的经验看，往往是BSA的效果好（难道是奶粉里的三氯氰胺在作怪？哈哈，玩笑话），所以现在摸条件我都懒得用奶粉（冒着被老板训斥的危险，呵呵）。封闭的浓度，还有封闭液的种类这些要去仔细的摸，有的抗体吐温加千分之一，有的加千分之五，有的用PBS有的用TBS，有的时候差别还挺大的，以前无聊的时候比较过。还有一个步骤可以降低背景，就是洗完一抗再加二抗之前，用封闭液再封闭10-20分钟，也许会有所改进。
做WB的兄弟姐妹们加油，明天偶要继续做WB
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#问号#[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

检查下试剂看看。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我弱弱地问一句,大家的一抗都不回收的吗?
或者,不用的一抗稀释液稀释的一抗,反复用没有问题吗?
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我上周的实验也出现了背景高的问题,

结果换了一只二抗就解决了问题.

个人觉得,二抗也应该纳入背景高的诱因之一.
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