蛋白质与蛋白组学

感谢楼主！
请教你的上样量？

从siashq 上样量来看，blue silver与考染一样，也用1mg，显色效果提高，
但是与银染间的比较呢？
electrophoresis那篇文章提到的上样量好像没有这么高？好像都是0.1mg

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谢谢！

原文作者的上样量确实是100ug，而且图不错。
不过2D的影响因素很多，况且个人的标本不同，要根据情况。
我的观点是，只要在同样上样量的情况下，三块平行胶的灵敏度递增，就能够说明问题了，至于是否象原文作者说的那么灵敏（达ng级），就不好说了。
所以我所做的三块胶的上样量相同，都是1.5mg左右，很明显，对于银染上样量过大，横向条纹都出来了。
不过对于前两者图还不错。
有时间你可以按照银染上样比较，再按照考染上样量比较。
我只按照考染上样量比较了。
因为最近我正好要做质谱。这种方法的成功，对于我来说太及时了！而且我所要的点，用一般考染，多数出不来，而用blue sliver却出来了，这就足够了。

楼主能否介绍你的实践中的步骤和经验？
我最近会每天做两块这种染色方法，急需大家的交流和指教！
先谢谢大家！

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我的步骤如下，供大家参考：
1、染液配制：下午要染色，上午十点我就开始配制染色液（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇，总体积500ml）：取42ml H2O+58ml H3PO4（85％）烧杯中混匀，再称取50g 粉末状（NH4）2SO4倒入烧杯，搅拌至完全溶解，大概半小时左右（NH4）2SO4是96年国产，实验室以前用剩下的，很好溶解，没有发现snow110说的不易溶解的现象。当然，如果难溶，多加点水没什么不可以的，呵呵）,然后加入 0.6g G-250 搅拌，至下午三点左右（其间我发现染料经常附着在烧杯壁上，所以不时用水冲），最后倒入量筒用水定容到400ml ，再量取100ml甲醇，边搅拌边加入，搅拌均匀。

2、染色
固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;
水洗: 去离子水 15min × 4;
染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜。染色时间约13小时。
3、脱色: 去离子水洗。我发现盛胶槽中的颗粒状染料不易洗去，建议脱色时更换盛胶槽。我的脱色时间大概1个小时，换了5次水，结果背景较高。

关于灵敏度，我的体会是这种方法比传统考染来有些提高，比起银染来，还是要差些。结果如下图（从左到右：传统考染（上样量1mg），blue sliver（上样量1mg），银染（上样量0.1mg））

我今天试着改变了一下试剂配制方法，染的片子还可以，而且配制速度很快，有兴趣的朋友不妨试试：
1.磷酸加水没什么特殊的。
2.将G250加入所需量的甲醇，是不是很快溶解了？好像溶解度非常大（至少是原来的2、3倍）。
3.将硫酸铵加入其2倍以上质量的水中，很快溶解了吧。
4.将G250－甲醇溶液慢慢加入硫酸铵溶液中，并不停晃动硫酸铵溶液。
5.最后加入磷酸水溶液，定容。
不到20min，是不是很快？而且没有原来那种大块沉淀。其中需要注意的是要将G250－甲醇溶液加入硫酸铵溶液，不要搞反，并不停晃动，不然有沉淀析出，不过有沉淀析出也没关系，晃动后又会溶解。
我试了一下，至少G250的最终溶解度可达原来2倍以上。

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可是原文作者为什么不这么配制，而是先磷酸、水，再硫酸氨，再250，再水，再甲醇呢？
我想既然是“胶体”考染法，有可能就是为了部分溶解，部分形成胶体颗粒。如果又快，溶解又好，染色效果又好，那也不防这样配。