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标题:【讨论帖】喷血推荐blue sliver胶体考染法

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请问各位大虾,我配制的blue siver染液中有许多颗粒状的G-250没溶解,这样最终浓度就达不到0.12%,不知大家有没有遇到这种情况,要不要过滤除去?若除去了,会降低灵敏度吧?
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fei1226com[使用道具]
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请问各位大虾,我配制的blue siver染液中有许多颗粒状的G-250没溶解,这样最终浓度就达不到0.12%,不知大家有没有遇到这种情况,要不要过滤除去?若除去了,会降低灵敏度吧?

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既然是胶体考染,可能就是要形成胶体颗粒,所以我想应该是正常的,而且我配的也是这样。建议不要过滤去除。
会不会影响灵敏度,你可以比较一下,用事实说话,最有说服力。
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qiangren789[使用道具]
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原文作者的上样量确实是100ug,而且图不错。
不过2D的影响因素很多,况且个人的标本不同,要根据情况。
我的观点是,只要在同样上样量的情况下,三块平行胶的灵敏度递增,就能够说明问题了,至于是否象原文作者说的那么灵敏(达ng级),就不好说了。
所以我所做的三块胶的上样量相同,都是1.5mg左右,很明显,对于银染上样量过大,横向条纹都出来了。
不过对于前两者图还不错。
有时间你可以按照银染上样比较,再按照考染上样量比较。
我只按照考染上样量比较了。
因为最近我正好要做质谱。这种方法的成功,对于我来说太及时了!而且我所要的点,用一般考染,多数出不来,而用blue sliver却出来了,这就足够了。

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哥们我看了一下,ng肯定没有,大概10ng级吧,和我普通胶粒考染连续三次的灵敏度相当,不过确实值得尝试!在此谢谢各位!另外作者是指标准蛋白达到了ng,具体在2-D中的情况又是另外一回事了,呵呵,原因多多
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qiangren789[使用道具]
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既然是胶体考染,可能就是要形成胶体颗粒,所以我想应该是正常的,而且我配的也是这样。建议不要过滤去除。
会不会影响灵敏度,你可以比较一下,用事实说话,最有说服力。

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是了,就是不要过滤
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S6044[使用道具]
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最近忙着出国还是实验还是考试还是拍拖还是照顾孩子?主任不来,这块不够火呀!
跟主任汇报,最近我一共做了30多块这种考染法,准备本月中旬去鉴定。

最后一下!看你出不出来!!

再不出来峰,我就跳楼!!
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applebook=213[使用道具]
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别过于乐观。
考染做质朴虽然比银染容易出峰,几乎个个漂亮,但是搜索结果却不一定那么好。 其中一个原因就是上样量过大,分离没有小量那么充分。所以PMF的峰特多,但是杂,经常是混合物。而目前的MASCOT等无法分析过于复杂的PMF。
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any333[使用道具]
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哥们我看了一下,ng肯定没有,大概10ng级吧,和我热考染连续三次的灵敏度相当,不过确实值得尝试!在此谢谢各位!另外作者是指标准蛋白达到了ng,具体在2-D中的情况又是另外一回事了,呵呵,原因多多

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热考染三次?灵敏度会提高吗?
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别过于乐观。
考染做质朴虽然比银染容易出峰,几乎个个漂亮,但是搜索结果却不一定那么好。 其中一个原因就是上样量过大,分离没有小量那么充分。所以PMF的峰特多,但是杂,经常是混合物。而目前的MASCOT等无法分析过于复杂的PMF。

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既然这样,您是如何把握考染点的胰酶用量或浓度或者酶切时间的?高分子量蛋白和低分子量蛋白的酶切有什么不同?
急!大家快帮我!谢谢!!
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我们用的是PROMEGA的trypsin gold, 因为修饰过的酶,自降解峰只有842和2211两个,所以酶一直都使用过量,从银染到考染都用差不多的量: 约200ng/点--5、6点。因为200ng是远远过量的。
有些人认为低分子的蛋白质酶切位点少,应缩短酶解时间。但我从14-16h,降到8-10个小时,好像没什么本质的变化。不知是不是缩短的时间不够。
其实不管高或低分子,蛋白量才是关键。所以考染容易出峰。如果2维分离的好,“乱做“都不会差到哪去。不用担心。
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avi317[使用道具]
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“如果2维分离的好,“乱做“都不会差到哪去。不用担心。 ”希望象您说的那样!
谢谢您的鼓励!我自信我不会跳楼了。
质谱回来我会向大家汇报的!!
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