蛋白质与蛋白组学

现在我改用5%BSA+TBST的blocking buffer和一抗，pH值应该在10.0左右。
那我想问洗脱液需要pH7.5吗？因为我看别人的pH有很多种。

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中性比较好，pH太高或者太低可能损伤抗原

貌似没有人回答问题4...
那我来回答吧。
如果，你的眼神够好，铅笔磨的够细，你甚至可以在膜上画画...
不要画到蛋白条带上即可，对实验无影响。
另：请在封闭之前，即转膜完后“作画”。

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答案是性的..........但是那个PVDF膜有点厚度，铅笔画下去之后就凹下去了，其实我是想把条带从中间分开的，而不是条带间

你用的是什么酶抑制剂？一般来说肯定是要加的，因为细胞加到上样缓冲里加热到蛋白酶彻底失活中间怎么也要几分钟时间，某些丰度不高的蛋白可能直接就没了

还有要注意的是样品不能太复杂，否则大小类似的蛋白会相互干扰，加大上样量也没用。裂解不充分的话和DNA结合的蛋白被核酸包被，也容易出现异常。建议你用ripa裂解后超声或者反复抽吸，感觉样品不是很粘稠后高速离心15min取上清跑胶。

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用的是calbiochem的，
磷酸酶抑制剂是#524625：咪唑200mM，氟化钠100mM，钼酸钠115mM，钒酸钠100mM，酒石酸钠400mM，稀释100倍用。
蛋白酶抑制剂是#539134：AEBSF，Aprotinin，bestatin，E64，leupeptin，pepstatinA，

RIPA是thermo的#89900 1X的，还没用，之前一直使用CST的blue loading buffer碎细胞，稀释到1X来碎细胞。

CellSignaling T的 blue loading buffer
3X Blue Loading Buffer Pack: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25?C), 6% (w/v) SDS, 30% glycerol and 0.03% (w/v) bromophenol blue. (Store at room temperature.)

30X Reducing Agent: 1.25 M dithiothreitol (DTT) (Store at -20?C.)

因为之前觉得温度高了些没什么的，也觉得保持低温挺难。
没有4度吊篮离心机，只有1.5mlEP的4°离心机。-70°冰箱的雪花，用来不知道能不能用一下。
按理说应该是细胞裂解之后才要保持低温的吧？请教您有什么好方法呢？

因为做的是人的B细胞，样本量很少，能有个5*10^6算不错了。每次离心之后大概都会（回流）留下180ul的液体在15ml离心管底，不一定有沉淀，但是那一丁点液体的细胞非常多，就是离心离不下去，我想直接加PPI/PI和10X的RIPA进去，然后放到制冰机/-20度冰箱里面裂解10min，不知道行不行。但是10X的RIPA，我没有。有些试剂也没有。

目标蛋白本事一个是BCR在膜上，之前的blue loading buffer好像还可以，量还挺丰富的，也就这样吧可能是SDS厉害。
两个是蛋白的激酶。
一个是蛋白磷酸酶，就怕这个会被酶抑制剂搞坏了。

用的是calbiochem的，
磷酸酶抑制剂是#524625：咪唑200mM，氟化钠100mM，钼酸钠115mM，钒酸钠100mM，酒石酸钠400mM，稀释100倍用。
蛋白酶抑制剂是#539134：AEBSF，Aprotinin，bestatin，E64，leupeptin，pepstatinA，

RIPA是thermo的#89900 1X的，还没用，之前一直使用CST的blue loading buffer碎细胞，稀释到1X来碎细胞。

CellSignaling T的 blue loading buffer
3X Blue Loading Buffer Pack: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25?C), 6% (w/v) SDS, 30% glycerol and 0.03% (w/v) bromophenol blue. (Store at room temperature.)

30X Reducing Agent: 1.25 M dithiothreitol (DTT) (Store at -20?C.)

因为之前觉得温度高了些没什么的，也觉得保持低温挺难。
没有4度吊篮离心机，只有1.5mlEP的4°离心机。-70°冰箱的雪花，用来不知道能不能用一下。
按理说应该是细胞裂解之后才要保持低温的吧？请教您有什么好方法呢？

因为做的是人的B细胞，样本量很少，能有个5*10^6算不错了。每次离心之后大概都会（回流）留下180ul的液体在15ml离心管底，不一定有沉淀，但是那一丁点液体的细胞非常多，就是离心离不下去，我想直接加PPI/PI和10X的RIPA进去，然后放到制冰机/-20度冰箱里面裂解10min，不知道行不行。但是10X的RIPA，我没有。有些试剂也没有。

目标蛋白本事一个是BCR在膜上，之前的blue loading buffer好像还可以，量还挺丰富的，也就这样吧可能是SDS厉害。
两个是蛋白的激酶。
一个是蛋白磷酸酶，就怕这个会被酶抑制剂搞坏了。

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http://www.cellsignal.com/products/9803.html
看上面那个CST的操作手册

如果是贴壁细胞的话一般是直接加1xRIPA然后刮取，非贴壁细胞则是离心后每10^7个细胞加400ul裂解液。
细胞太少的话15ml离心确实很难沉下去，可以考虑多装几个1.5ml小管

用的是calbiochem的，
磷酸酶抑制剂是#524625：咪唑200mM，氟化钠100mM，钼酸钠115mM，钒酸钠100mM，酒石酸钠400mM，稀释100倍用。
蛋白酶抑制剂是#539134：AEBSF，Aprotinin，bestatin，E64，leupeptin，pepstatinA，

RIPA是thermo的#89900 1X的，还没用，之前一直使用CST的blue loading buffer碎细胞，稀释到1X来碎细胞。

CellSignaling T的 blue loading buffer
3X Blue Loading Buffer Pack: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25?C), 6% (w/v) SDS, 30% glycerol and 0.03% (w/v) bromophenol blue. (Store at room temperature.)

30X Reducing Agent: 1.25 M dithiothreitol (DTT) (Store at -20?C.)

因为之前觉得温度高了些没什么的，也觉得保持低温挺难。
没有4度吊篮离心机，只有1.5mlEP的4°离心机。-70°冰箱的雪花，用来不知道能不能用一下。
按理说应该是细胞裂解之后才要保持低温的吧？请教您有什么好方法呢？

因为做的是人的B细胞，样本量很少，能有个5*10^6算不错了。每次离心之后大概都会（回流）留下180ul的液体在15ml离心管底，不一定有沉淀，但是那一丁点液体的细胞非常多，就是离心离不下去，我想直接加PPI/PI和10X的RIPA进去，然后放到制冰机/-20度冰箱里面裂解10min，不知道行不行。但是10X的RIPA，我没有。有些试剂也没有。

目标蛋白本事一个是BCR在膜上，之前的blue loading buffer好像还可以，量还挺丰富的，也就这样吧可能是SDS厉害。
两个是蛋白的激酶。
一个是蛋白磷酸酶，就怕这个会被酶抑制剂搞坏了。

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http://www.cellsignal.com/products/9803.html
看上面那个CST的操作手册

如果是贴壁细胞的话一般是直接加1xRIPA然后刮取，非贴壁细胞则是离心后每10^7个细胞加400ul裂解液。
细胞太少的话15ml离心确实很难沉下去，可以考虑多装几个1.5ml小管