【求助】纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗 - 经验共享

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗

23 2/3 ‹‹1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗

zhezhe[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72891
精华 1
积分 610
帖子 856
信誉分 102
可用分 5088
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-6-8 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问如果两者都是在不用还原剂的条件下哪个更稳定呢？谢谢

==========================================================================================

毫无疑问，无论是理论上还是实践上，在鳌合镍方面都是NTA比IDA稳定。而且很多时候NTA纯化的效果都比IDA要好一些。

但是如果都不用还原剂的话，我肯定是选择IDA，而不是NTA。

原因有三个方面
1、价格，相差有3-4倍吧。
2、再生性能，IDA柱反复再生个几百次都没问题。
3、载量，可能有成倍的差异。

9900[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2013-6-8 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

IDA柱耐还原剂及特异性完全可换成钴离子改善,这时候多大浓度的还原剂都不成问题.

小游abc[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108891
精华 0
积分 256
帖子 231
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2013-6-8 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，楼上大师出手了。

钴离子我试过一次，但是完全不成功。我把我的程序讲一讲，还请韦兄指点。

1、填料chelating Sepharose FF， GE，国产16/20柱，20ml装胶量，多次使用过旧胶，20%乙醇保存，AKTA explorer 100。
2、水洗：去离子水洗大于5个柱体积
3、脱镍：50mM EDTA.2Na水溶液，至柱完全变白，电导和pH稳定
4、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH稳定
5、再生：0.5N NaOH洗柱至紫外280、260均回归基线
6、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH基本在中性偏碱
7、挂钴离子：100mM CoCl2水溶液，大于5个柱体积
8、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH基本在5-6
9、平衡：pH8.0,20mMPB,0.5NNaCl,40mM咪唑至柱完全变颜色，紫外280小峰过，电导和pH与bypass缓冲液完全相同
10、还原：新配制1mM DTT加平衡缓冲液，溶液一进入柱中，填料立即变色，流出液有钴离子沉淀及深色
11、拆柱，烧杯倒出填料，加20乙醇，4度放置，大约有4-5个月了，还是深深的钴离子沉淀颜色

这个程序基本是按说明书做的，只是常用的硫酸镍改成了氯化钴，再就是加了DTT。
不知道问题出在哪儿，请韦兄指点一下，为什么我用钴离子也是不耐还原剂的？

star#room[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态离线

发表于 2013-6-8 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也不是大师,钴离子我记得用的是硫酸钴,是粉色的,理论上钴离子已经是最低价,不会被还原的,我记得曾经用巯基乙醇和半胱氨酸试过,当时没怎么调pH,你可用巯基乙醇试试,此外pH调到7点多试试.此外所用填料是我们自己的镍琼脂糖凝胶,进口的我没试过.可参考下面的文件,说明书上写30mM巯基乙醇内没问题,大多样品浓度用5mM左右应该足够,毕竟蛋白浓度没那么高,不需要太大浓度的还原剂.

理论上来说镍柱如果合成的对,那配基是不会脱落的,镍离子就可以反复固定,其实填料有时配基脱落是填料本身设计时化学键不牢固造成的,这样通常按说明书做可延长寿命,另外主要是杂质包裹导致失效,可再生能恢复,还有一种情况是填料本身如琼脂糖凝胶分解或断裂导致失效.的确IDA三百次左右是完全没问题的,但是需要有效清洗.而特异性可通过洗脱和改变吸附条件一样能达到NTA的效果,此外NTA理论上也不会不能反复用,只是再生没解决好而已.通常情况下个人觉得IDA已经足够,如果需要特异性好点,那就牺牲载量,这样作用力弱,对一些本身作用力弱的蛋白可能会挂不上.所以可把IDA上挂钴离子,这样作用力弱了,背景会更干净,但是载量是肯定会下降的.

utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态离线

发表于 2013-6-8 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

硫酸钴还是CoCl2，我买过，很容易潮解和“冒烟”

至今被我冷落在哪个不知名的实验台柜子的底层了

小游abc[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108891
精华 0
积分 256
帖子 231
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2013-6-8 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但从产品说明上看clontech的介质也是NTA类型的，与这里讨论的IDA耐还原剂问题有差别。是否IDA挂上Co离子就可以耐还原剂仍然是个谜。我做失败了，chromatography做成功过，唉，不知我的程序错在哪儿。

小游abc[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108891
精华 0
积分 256
帖子 231
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2013-6-8 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上面一个图是clontech的，下面一个图是qiagen的Ni-NTA，配基作用相同。

bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态离线

发表于 2013-6-8 16:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

clontech的介质不是NTA类型的，是CM-ASP类型的。和NTA一样都是螯合四价的。CM-ASP比NTA具有更好的特异性，基本没有非特异性的吸附。
最近，clontech还推出了IDA的树脂。结合能力达到惊人的60mg/ml，名字就叫作His60 Ni Superflow。
其实，clontech的介质要比NTA便宜15%左右！
大家不妨关注一下。
cuturl('http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_family_id=1424&product_group_id=1459&product_id=212698')

memory[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

发表于 2013-6-8 16:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bluelake 于 2013-6-8 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

clontech的介质不是NTA类型的，是CM-ASP类型的。和NTA一样都是螯合四价的。CM-ASP比NTA具有更好的特异性，基本没有非特异性的吸附。
最近，clontech还推出了IDA的树脂。结合能力达到惊人的60mg/ml，名字就叫作His60 Ni Supe ...

个人觉得都是四价螯合,所以CM-ASP类型和NTA没本质区别.而60mg/ml这不难达到,只是个别蛋白或动态吸附载量.有时间我再做钴离子的试试,详细情况到时候告诉大家,CM-ASP类型的不是很难合成.钴离子的理论上在IDA上应该也不容易被还原,至少我做的是这样.

小游abc[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108891
精华 0
积分 256
帖子 231
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2013-6-8 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

多谢指点。当时比较了一下两者鳌合镍的方式，都是三个羧基一个N原子，就认为是相同的，鲁莽了。二者在其中一个羧基的位置上有差异。

但这些都不能解释IDA与还原剂是否兼容的问题。

23 2/3 ‹‹1 2 3 ››