比较蛋白质组学

1）分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

2）分离细胞膜蛋白的方法：
1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)

3）分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。

4）分离组织膜蛋白的方法：
1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。

5）分离组织膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
以下用时加入
10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）
Aprotinin（30ul/ml）
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）

冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。
取上清-20保存。

6）分离细菌膜蛋白的方法：
① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。
② 10000g、20min、4℃离心，去上清。
③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④ 超声波破碎细菌。
⑤ 3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
⑥ 超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。
⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。
⑧ 超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。
⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)

7）来源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。
2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。
4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。
7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析

8）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在4摄氏度下进行）
1.在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。
2.加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。
3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。
4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。
5.上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。
6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min，弃上清。
7.用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。
8.粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。

9）用特殊的去污剂选择性的分离。简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
方案
1、放射性标记受试细胞
2、将标记的细胞放在冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
6、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
9、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
10、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3）buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)

10）植物中：高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度离心、2水溶性双水相法、3自由流电泳等方法为主。前两种常用。1的产率较高但纯度不高，2是20世纪80年代发展起来的一种分离高纯度质膜的方法，经多次双水相分配即可得到高纯度质膜，近些年此方法广泛用于植物质膜的纯化。