小中大
供讨论
1.诱导温度的选择是以什么为标准（产量与表达蛋白的分离率）建议查文献核实
2.菌液离心后上清做SDS-PAGE检测。看是否有目的蛋白，并收集。多次洗细菌沉淀并重悬细菌，超声只破碎离心收集的细菌细胞（防止菌液内已经有的蛋白在超声时与细菌一起超声变性发生分层）
3.超声破碎细菌细胞,并纯化包含体后裂解释放包涵体，离心收集上清跑电泳看是否有目的蛋白，有收集，并收集包含体，对其处理如下（包含体的处理是我在园子里找到的，你在园子里搜索一下）
10 000 r·min - 1离心15 min ,弃上清。
将沉淀用3 mol·L - 1尿素含0. 2 g·L - 1 TritonX2100 反复洗涤处理得到纯化的包涵体, 称重。
包涵体用8 mol·L - 1 尿素含10 mmol·L - 1二硫苏糖醇(DTT) 溶解变性。
复性:
包涵体溶解变性后10 000 r·min - 1离心15 min ,清除不溶性杂质。
上清直接用复性液: 50 mmol·L - 1 Tris·Cl , 1 mmol·L - 1 EDTA , 1 mmol· L - 1苯甲基磺酰氟(PMSF) ,不同浓度的氧化型谷胱甘肽( GSSG) ,还原型谷胱甘肽( GSH) 稀释,使蛋白质终浓度不超过100 mg·L - 1 ,尿素终浓度为0. 5～ 1. 0 mol·L - 1 ;在其他条件不变的情况下,分别改变GSSG和GSH 浓度、温度及复性时间,PEG20000 浓缩后,离心。
测上清总蛋白质量,计算复性率,找出最佳复性条件。
4.溶菌酶10mg/ml。在作用过程中菌液的pH会下将，所以最好多次重新调节pH>8(你查一下它的作用原理以及大肠杆菌的特性就知道）
5.冻融法我们是10次，最少六次
6.我感觉蛋白表达影响菌体细胞壁的结构的可能性较小，主要还是包含体的处理上（我也是新手）见笑了，供大家一起学习
7.关于前辈级机器，如果前辈用可以，那么你应该在自己漠漠条件了
