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标题:【求助】蛋白表达及菌体破碎问题

windy+++[使用道具]
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什么是时间双因子\培养基多因子优化?应该怎么做呢,烦请能不能再说的具体一些?前天我做了一下20度诱导表达(200ml),40mlPBS悬起以后超声破碎(方法同前)。之后,菌液还是有些混浊,并取了100ul与全菌对照涂平板培养,发现还是长出了菌落,这是不是也可以说明细胞并未破碎啊?
取1ml裂解液分别以6000转、12000转离心分获沉淀和上清,洗涤沉淀后,制样跑电泳,发现目的蛋白仍主要存在于6000转沉淀中(箭头所示),但与以往不同的是,6000转的菌体蛋白少了,而12000转菌体蛋白较之以往有所增加。与之相对应的一杂蛋白(椭圆所示),与目的蛋白恰好相反,主要存在于12000转沉淀,如果此杂蛋白是包含体形式的话,那么我的目的蛋白又是以什么形式存在的呢?
附图如下:从左至右依次为6000转、12000转、上清和Marker。请各位大侠指教!


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2013-6-27 11:24
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yueban-1147[使用道具]
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你以前以为破菌不完全的原因:
诱导时间太长,没有人在37度诱导过夜,这样的话菌都已经死了,而且都自溶了,所以你离心收菌得到的已经都是包涵体和少量没有自溶的菌体,这样无论怎么破菌上清里都没有多少菌体蛋白了。你的没有加IPTG的对照就很正常,没有这种自溶现象。

不知道你的6000转无法离心下来包涵体的概念是怎么来的。首先6000转的说法就不科学,应该根据你使用的转头半径大小换算成g,才能反映真实离心力大小,现在的新离心机上都能直接看到g。再说一般的转头6000转已经能把大部分包涵体沉淀下来了,如果时间够长,包涵体基本上都能沉淀下来。

你的电泳照片显示你的目的蛋白在包涵体里,6000转已经把90%以上的包涵体沉淀下来了。12000转出现的两条主要的杂带我认为不存在于包涵体里,而是位于细胞膜上的膜蛋白,12000转(拜托换算成g)把细胞膜的大碎片离心沉淀下来了。

建议只用6000转离心下来的还算比较纯的包涵体,扔掉12000转的沉淀。
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喇叭花[使用道具]
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1,诱导时间太长,没有人在37度诱导过夜,这样的话菌都已经死了,而且都自溶了?
不敢苟同老兄的意见。虽然我用的菌是BL21(DE)plysS ,可以表达少量T7溶菌酶,但它在细胞内部是不能攻击细胞壁的,也就是说它只能在细胞破碎以后才能发挥有限的溶菌效果,这也恰恰是我用这个菌的目的之一。况且你的说法,与我涂平板的结果也不甚相符合。
2,6000转的表述方法的确不是很准确,这与所用离心机及所用转头有关,这是我的失误。我所用离心机为Sigma 1-13, 最大转速: 13.000rpm 、最大离心力:11.340 x ɡ,所以6000转换算成离心力也就5000g左右吧(这样对吗?请高手指教),在这样的离心力下一般是只能离出较大的细胞碎片的,包含体大小一般为0.5-1um,受到溶液浮力、相互静电斥力、布朗运动等因素的影响,必须在一定的离心力下才能沉淀,与离心时间是无关的,而这个离心力一般是12000g(好像在哪篇文献看到过,记不清了。分析是否正确?请高手指教。)
3,12000转出现的两条主要的杂带我认为不存在于包涵体里,而是位于细胞膜上的膜蛋白,12000转(拜托换算成g)把细胞膜的大碎片离心沉淀下来了?
细胞膜的大碎片不能够在6000转(5000g)离心下来吗?
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dongdongqiang[使用道具]
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看得出你是一位很认真的朋友,所以我会尽量找出根据来回答你。

1,37度诱导过夜导致菌体死亡破裂,不是因为你的plyss菌自身表达溶菌酶的原因,而是由于iptg的细胞毒性,一旦诱导,细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下,细胞将停止生长,形成克隆的能力大大降低,但并未死亡。在37度环境中,3-4小时内细胞都不会死亡。

但是如果过夜诱导,在这样的温度和营养已经耗尽的情况下,细胞应该会死掉一些,正好你的plyss菌自身的溶菌酶会加速这个过程,所以才会出现你描述的情况。所以大家在37度诱导时都是只诱导3-4小时。

因为没有人在37度诱导过夜,所以找不到根据支持我的观点,你涂平板的结果也不太能说明问题,我并没有说你的菌全部死掉了,不过你可以做一个稍微严谨一点的试验来验证一下我的推断,在同样的条件下37度过夜摇你的表达菌,一个加iptg,一个不加,然后分别稀释到合适的浓度涂平板培养,计算活菌数,我估计将会有1到2个数量级的差别。

2,如果你看过包涵体的电镜照片,你会发现包涵体还是很大个的,直径跟细菌差不多,而且密度很大,肯定是可以在6000转离心下来的。你可以看看这个protocol,也许对你的试验有帮助。 cuturl('http://www.fhcrc.org/labs/strong/StrongLabRefoldingProtocol.pdf') 他们就是6000转离心包涵体,Centrifuge to collect inclusion bodies (for example, 6000 rpm for 15 minutes),这个protocol有好几个经典文献支持,而且我认为他用6000转是有目的的,因为可以避免离心下来细胞膜碎片,使包涵体更纯。

3,我提过大肠杆菌膜蛋白,先是低速离心(肯定超过6000转,具体多少忘了),然后取上清4万5千转(or g)离心一小时得到细胞膜沉淀。所以低速离心是离不下来细胞膜的,应该是含有太多脂类物质密度太小的原因吧。

看你的id,是不是学蛋白晶体专业的?希望继续讨论^_^
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mimili_901[使用道具]
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1.从电泳来看,你做得还不错。
2.时间双因子:诱导前时间、菌浓;诱导后时间
3.培养基多因子优化:培养基成分
4.取了100ul与全菌对照涂平板培养,发现还是长出了菌落,这是不是也可以说明细胞并未破碎啊?
标准不对,存在误差,镱检才是标准。
5.杂蛋白是包含体形式的话,那么我的目的蛋白又是以什么形式存在的呢?
杂蛋白不是包含体形式存在。目的蛋白是包含体。
离的速度、时间还可少。
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gogo[使用道具]
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包涵体释放与温度有没有关系?
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超声破碎菌体

最近做原核表达。50ml菌液,28℃诱导4h。超声破碎用的是25ml悬浮液,超声之后和超声之前没有区别,还是浑浊的白色悬浮液 。我用的冰浴,超声10S,间隔15S,超声时长30min。发现有很多泡沫。超声后我进行全菌蛋白SDS-PAGE电泳,发现上清和沉淀以及全菌没有表达,原因是什么?哪位大神能帮忙指导一下?感激 ,可以1邮箱联系415977124@qq.com


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 上清全菌检测
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chenzhen2016[使用道具]
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首先,感谢你分享你的实验情况。蛋白表达和菌体破碎是复杂的实验过程,存在许多因素可能影响结果。下面给出一些建议可能帮助你解决问题:

蛋白表达影响菌体结构:蛋白的过度表达可能导致细胞负担过重,细胞壁结构受到影响,导致菌体破碎困难。你可以尝试降低IPTG诱导浓度或表达时间,看看是否有改善。

1.菌体保存:菌体保存条件和处理方法可能影响菌体的完整性。确保菌体在冻存时处于活跃状态,并避免长时间冻融处理。

2.超声波破碎条件:超声波破碎条件的优化很关键。你可以尝试调整超声波功率和处理时间,可能有助于更有效地破碎菌体。

3.裂解液的选择:裂解液的组成和浓度对破碎效果有重要影响。你可以尝试不同的裂解液组合,或者增加某些裂解液成分的浓度,看看是否会有更好的结果。

4.使用亲和纯化:如果你的目的蛋白是包涵体表达,可以考虑使用亲和纯化方法,如His-Tag标记或GST标记等。这可以帮助你更有效地纯化目的蛋白,而无需对菌体进行彻底的破碎。

5.与同行交流:有时候实验中的问题可能来自于实验操作或试剂的选择,你可以与同行交流,了解他们的经验和建议。

最后,建议你继续尝试不同的实验条件和方法,对比结果,找出最优的方案。实验过程中可能会遇到困难,但积极的探索和学习是解决问题的关键。祝你实验顺利,早日取得理想的结果!
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