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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Marker跑的怎样，看看是不是电泳缓冲液的问题。

==========================================================================================================

谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。
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finger[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想问SDS-PAGE的电泳缓冲液可以重复使用吗？另外，如果蛋白质降解了，跑出来的胶会是什么样子？

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电泳缓冲液是可以反复使用几次的，不过反复使用的缓冲液对于分辨率会有一些影响，尤其是双向电泳中。如果蛋白降解了，跑出来的胶应该会出现一些本来没有的条带，因为降解的时候是随机的，并不是延着二硫键断裂的。
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发表于 2013-6-27 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。

===========================================================================================================

一般认为10K以下的就算是肽了，而肽的话用普通的12.5%的SDS-PAGE分离就不太适合了。建议使用小肽胶，即tricine胶，具体的方法坛子里也有。
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xyw5[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于第一个问题，免疫原性应该还在，因为并不破坏抗原决定簇。可以不用考马斯亮蓝染胶，用KCL染就行
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1为诱导前，2为诱导后，3为Marker；依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4抗kD。312个aa，不是天然蛋白，是人工蛋白。

===========================================================================================

你的蛋白确实大了很多，并非正常现象，不知道你做诱导之前做过gene测序没有，有没有排除gene和载体上有突变的可能性。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。

=======================

同意，可以用tricine胶来试试！
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发表于 2013-6-27 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主,我现在作的western,蛋白分子量是256kd,但是,只查到了有212kd的预染marker,如果用这种marker来推断我的蛋白可不可以呢?如果不行的话,该选择什么样的marker呢?哪里可以买到这么大分子量的marker?毕业在即,实验还没有完成,急切求助!谢谢了!
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发表于 2013-6-27 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
见到 生工主页上有卖一种染色液
不用甲醇和醋酸，是否就是G-250染色液
在染色前他先把胶放水里，微波炉里煮沸，然后再染，也是微波炉煮
R-250 染色后，是否也该先煮一煮？或纯水冲洗一下。
银染也不麻烦，灵敏度又高，为什么倒不常用？除了需要打谱的原因。

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R-250染色中，适度升高温度是可以加快染色速度的。不知你所说的煮一下或用纯水冲一下是什么意思？
银染和考染都是实验室很常用的蛋白电泳染色方法，应该不存在你说的不常用。不过银染的灵敏度虽然高，但同时也易受干扰，可能会导致背景高。还有银染对组蛋白和一些酸性蛋白的来说非常困难。
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发表于 2013-6-27 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从头看到尾，真是受益匪浅！
在此我想请教一个问题：我用的是晶美（ferments）的marker，每次跑带都会跑丢两条，不知是怎么回事？
还有就是我准备跑一个小分子量的电泳，5000左右，marker说明书上让跑夹层胶，哪位同仁做过，请指导一下，谢谢！

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夹层胶就是一般的垂直电泳胶吧！参考一下蛋白质电泳书就可以了，或在园子这样的帖子也很多。
Marker跑丢，前面介绍过排除的方法，可参考一下。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主,我现在作的western,蛋白分子量是256kd,但是,只查到了有212kd的预染marker,如果用这种marker来推断我的蛋白可不可以呢?如果不行的话,该选择什么样的marker呢?哪里可以买到这么大分子量的marker?毕业在即,实验还没有完成,急切求助!谢谢了!

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没见过那么大的marker，有225KD的预染marker，不过与200KD的没什么区别。我想用200KD的做标准估计一下应该是没什么问题的！
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