蛋白质与蛋白组学

楼主的总结让人受益匪浅。
我有两个问题想请教：
1 我的电泳跑出来下面的一些条带（就是靠近溴芬兰的那端）总是比较糊，不知道会是什么原因呢？很多试剂都已经重新配过了。
2 电泳缓冲液中的甘氨酸是起什么作用呢？因为我看到两个配方，而其中仅甘氨酸的浓度有些差异
请大侠们指教！

==========================================================================================================

1. 我想问题可能有两个，一是你的样品制备的问题，另一个是不是你的胶浓度不是很合适。
2.甘氨酸的作用我也不是很清楚，但是它的浓度大应该可以促进蛋白泳动分离的速度吧？我也看到过有两个配方，仅甘氨酸的浓度不同，这两种我都用过，没有什么大的影响，哪个都可以，用甘氨酸少的那个即可。

我做的是乳酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，有两个问题：
1，胶凝的太快了，大概几分钟就凝固了。
2，加样后，样品不往凝胶里跑，不可能是正负极弄反了。
请各位高手指教。

===================================================================

1.你用的是什么配方，别人做过吗？是否正常？
2。电泳装置配置是否正常，比如带硅胶条的电泳槽是否去掉了硅胶条，内外槽是否正确安装。

楼主的总结让人受益匪浅。
我有两个问题想请教：
1 我的电泳跑出来下面的一些条带（就是靠近溴芬兰的那端）总是比较糊，不知道会是什么原因呢？很多试剂都已经重新配过了。
2 电泳缓冲液中的甘氨酸是起什么作用呢？因为我看到两个配方，而其中仅甘氨酸的浓度有些差异
请大侠们指教！

===========================================================================================================

1。排除试剂的原因，很可能就是胶的浓度问题，适当降低浓度试试。
2。甘氨酸主要在形成电泳电场形成中起作用。甘氨酸与Tris构成电极缓冲液，在浓缩胶和上样不buffer中都是PH6.8的tris-HCL,而在分离胶中pH8.9的tris-HCL缓冲液，所以，当蛋白质在浓缩胶里的时候，环境偏酸性，甘氨酸的电离较少，这时外在电场电流较小，蛋白质的整体涌动速度慢，而样品中的HCL为强酸，可有效电离，那么其中的电流涌动速度快，会使蛋白质样品内部有效浓缩，而整体缓慢推进。
当蛋白质样品进入分离胶时，环境偏碱性，此时，甘氨酸有效电离，整个电场中电荷增加，电流增大，从而使蛋白质样品随分子量的不同得到有效分离。
配方可采用分子克隆上的。

我用的是肺磷癌组织标本,上样量为20微克总蛋白,用SANTA CRUZ 的抗兔的针对annexin II 的抗体,1:1000稀释,显影后怎么会有两条带,我用10%和12%的胶都试了一次,都是两条带,是样品的时间久了吗?还会不会有其他原因,希望各位高手指点一下迷津,谢谢!!

================================================

我想大致应该有以下两个原因，你可参考以下：
1。蛋白条带的分子量是否正确，会不会出现蛋白质解离得问题。
2。是不是有可能是你的抗体纯度不够。

我做的目的蛋白的分子量是55kd,用Bio-Rad的系统,电泳是分离胶80V,浓缩胶120V,转膜是恒压100V,30min,分子量标准是invitrogen公司的预染marker,先说我现在遇到的问题:
1) marker在浓缩胶里面跑的好好的,但是到了分离胶就慢慢向右边扩散(marker加在最左边,它前面有两个孔什么也没加),做了好几次都是这样,而且歪的方向都一样(marker的上样量是6ul,说明书推荐的是5ul)
2) 转膜后丽春红染色, 十分难看,在比木的蛋白小的地方有几条条带,但是在木的蛋白大小的地方什么也没有,我觉得marker跑的距离没拉开,而且歪的厉害,所以很难看出问题,
明天再跑时多跑一会,小分子的蛋白会不会跑没了?
做了好几次都这样,郁闷死了,请各位高手指点,不胜感激!!

===========================================================================================================

如果条带正常的话,Marker一般不会有什么问题的，我想你所说的可能是因为样品的缘故导致marker跑斜，另外就是空泳道最好加点上样buffer，防止其他用到的样品扩散过来。
至于条带，只有等你marker正常的时候再讨论了