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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是肺磷癌组织标本,上样量为20微克总蛋白,用SANTA CRUZ 的抗兔的针对annexin II 的抗体,1:1000稀释,显影后怎么会有两条带,我用10%和12%的胶都试了一次,都是两条带,是样品的时间久了吗?还会不会有其他原因,希望各位高手指点一下迷津,谢谢!!

你好！我做的蛋白电泳也有这样的现象，而且是阳性对照的纯品！
我看资料解释说：是蛋白在上样处理过程中构象变化，可能出现的结果．
你查看一下蛋白结构和性质，可能会有帮助！
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品处理：我是两毫升菌液离心沉淀后加80ulＰＢＳ加20ul 5乘上样缓冲液，煮沸５分钟，离心　取１５ul 上样的．
我的条带上面是清晰的下面有些糊，因为只有１５ＫＤ左右大小所以用的是１５％的胶．可是请问小蚂哥：
胶的浓度高为什么会糊呢？觉得浓度高应该分得更清楚啊
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主一个问题：
做SDS－PAGE，点样后一加上电压开始跑，有的点样孔中的溴酚兰就开始向下漏，一直漏到浓缩胶和分离胶的交界面上，然后横向扩散。当其他孔中的溴酚兰迁移到分离胶和浓缩胶的分界面后，扩散的溴酚兰再同其他孔的溴酚兰一起向下迁移。脱色后发现出现渗漏的孔对其他孔有影响，但不严重。每次大约有1－2个孔出现这种现象。请问这种现象是什么原因造成的，应如何改进？

===============================

不知道你所说的漏是什么样的？
我想可能有两个原因会出现这样的情况：
1、胶没有充分凝固；
2、玻璃板与胶结合的不严密，出现空隙。
自己查找一下，看看是那种原因。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品处理：我是两毫升菌液离心沉淀后加80ulＰＢＳ加20ul 5乘上样缓冲液，煮沸５分钟，离心　取１５ul 上样的．
我的条带上面是清晰的下面有些糊，因为只有１５ＫＤ左右大小所以用的是１５％的胶．可是请问小蚂哥：
胶的浓度高为什么会糊呢？觉得浓度高应该分得更清楚啊

==========================================================================================================

PAGE电泳受凝胶孔径大小不同影响，有分子筛的效应，不同浓度的分离胶都有特定的分辨率范围，浓度过大过小都不能有效分离。过高浓度的分离胶可能会导致样品在电场的作用下，涨破凝胶，出现不均匀的分布，出现一种类似拖带现象。
样品处理操作看起来没什么问题，你可以改进一下胶的浓度。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？

====================================================================================

你先做个DOT－ELISA摸一下抗体工作浓度，另外就是封闭液有没有问题，最后再看看显影时间的问题，可逐一排除
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主：
我电泳时，溴酚兰指示剂总压不成一条带，并且跑到底端时开始变黄，不再泳动了，这是什么原因啊
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，我想问一下10％分离胶和4％浓缩胶用36mA恒流来跑电泳会不会不适合？是否电流太大了点？
还有，电泳时放把整个电泳槽放在4℃低温下进行电泳是不是合理的？为什么？
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DNA[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主：看了 你的帖子，受益非浅！
请教：本人最近在做蛋白纯化，请问各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶，加缓冲液提取。能否请问一下具体方法如何。也请各位高手多多指教。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教搂主：我最近在跑一个分子量约170KD的蛋白，基层胶和分离胶都是5%，用的是恒压，100V，跑的效果不是很理想，丽春红染色后100KD以下条带都很清楚，但100KD以上就很模糊了，杂抗体后显影出来也是如此。请问有什么办法可以解决吗，除了5%，浓一点的分离胶可以吗？另外，在同一块胶上，我还需要跑分子量为42的内参，不知道如何才能把这两个蛋白都跑出来，我已经失败了N次了，急盼回复，谢谢
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