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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

ukonptp[使用道具]
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请教楼主:
我电泳时,溴酚兰指示剂总压不成一条带,并且跑到底端时开始变黄,不再泳动了,这是什么原因啊

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这种情况一般都是缓冲液的问题。
1、电极缓冲液使用次数过多,建议重换;
2、凝胶缓冲液pH不正确,建议调准确。
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00无名指00[使用道具]
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请教关于转膜后封闭的问题:用1%BSA封闭1小时,DAB染色较多非特异性条带。后用5%牛奶(脱脂、高钙、高蛋白),其它条件相同,结果未见任何条带。不知何原因,多谢指点!
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ukonptp[使用道具]
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楼主,我想问一下10%分离胶和4%浓缩胶用36mA恒流来跑电泳会不会不适合?是否电流太大了点?
还有,电泳时放把整个电泳槽放在4℃低温下进行电泳是不是合理的?为什么?

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1、应该没有问题,不过可适当减小点,防止过大产热。
2、没必要放在4C,从理论上来说也没什么妨碍,不过可能回使电极上锈。
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kulee[使用道具]
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请教一个问题:我在看别人跑SDS-PAGE的时候,发现他们在电泳巢里倒的是阳极缓冲液而在板间却是倒的阴极缓冲液,就是所谓的内阴外阳.请问这样做的目的是什么,是什么原理啊?
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079777chao[使用道具]
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各位,我的电泳最近不知出了什么问题,总是在分离胶的中上部每个孔对应的地方出现一大块的蓝色,下面是我 的一块电泳的照片
我和人讨论的初步结果是,那块可能不是蛋白质,因为它怎么脱色也不太退色,但是又是什么能跟考马斯亮蓝这样结合,而且又只在每个加样孔有,我们没想出来。

请各位帮我看看吧,我都急死了


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2013-6-27 17:52
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remenb[使用道具]
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本人最近在做蛋白纯化,请问各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶,加缓冲液提取。能否请问一下具体方法如何

以下是我收集的从PAGE回收DNA的方法不知对你有用否:
"压碎与浸泡法"1)用刀切下含目的条带的凝胶.2)将凝胶块转移至微量离心管,用一次性使用的吸头对着管壁将凝胶挤碎.3)估计凝胶块的大致体积,在微量离心管中加1-2倍体积的洗脱缓冲液.洗脱缓冲液:0.5mol/L乙酸铵.10mmol/L乙酸镁.1mmol/L EDTA (PH8.0) 0.1%SDS 当洗脱缓冲液的体积不大于0.5ml时,操作更为方便.因为洗脱的DNA片段可在一个微量离心管中用乙醇沉淀.4)盖上离心管盖,旋转平台上37摄氏度温育。小片段DNA(<500bp)的洗脱需3-4小时,更大的片段需12-16小时.5)用微型离心机于4度12000g离心一分钟.将上清液转移至另一微量离心管.6)上清液通过一次性使用的塑料层析去除残留的PAGE凝胶块.7)加两倍体积处于4度的乙醇,冰上放30分钟 ,微量离心机4度12000g离心10分钟以沉淀DNA
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remenb[使用道具]
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请问一下楼主,我现在的胶浓度是7.5%,浓缩胶是5%的,每次跑电泳的时候在分离胶里面都跑的特别快,我用了100v的电压,每次的电流大概是18mA左右,本来应该要跑5-6个小时的,但是每次跑2-3个小时,溴芬兰就全部到达了底部,我用的是预染的marker,在分离胶上看得到分离出来的条带,有6条的样子,但是为什么总是跑的这么快呢?对实验结果会有什么样的影响呢?
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请教楼主:我要从SDS-PAGE胶中回收蛋白亚基,是考染后再切胶回收吗?
那样考马斯亮蓝能从蛋白上除去吗?还有SDS用不用除去,蛋白亚基用不用复性?我是要回收蛋白亚基,然后制抗体,我认为考马斯亮蓝和SDS可能会影响亚基的抗原性的,所以要从蛋白上除去。
望不吝赐教
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硫酸铵沉淀蛋白后,沉淀用水溶解,然后透析出去硫酸铵,最后离心获得的上清和沉淀分别电泳,沉淀用尿素溶解后跑胶条带很清楚,但上清跑出来上宽下窄,连成一片。不知是不是残留的硫酸铵的影响。
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ukonptp[使用道具]
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请教搂主:我最近在跑一个分子量约170KD的蛋白,基层胶和分离胶都是5%,用的是恒压,100V,跑的效果不是很理想,丽春红染色后100KD以下条带都很清楚,但100KD以上就很模糊了,杂抗体后显影出来也是如此。请问有什么办法可以解决吗,除了5%,浓一点的分离胶可以吗?另外,在同一块胶上,我还需要跑分子量为42的内参,不知道如何才能把这两个蛋白都跑出来,我已经失败了N次了,急盼回复,谢谢

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170KD的分子量不算小,你的积层胶用5%可能有点大,可以适当的调低点,比如3%,分离胶可以适当大点,6-8%,试试看吧。
分子量差异比较大,我没有做过,你可用上面的浓度先做一下电泳,看看能不能把你分子量相近的蛋白有效分开。
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