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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

remenb[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢我去试试看，再请教一个问题，选择3％积层胶是不是为了让大分子量蛋白更好的通过
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题:我在看别人跑SDS－PAGE的时候,发现他们在电泳巢里倒的是阳极缓冲液而在板间却是倒的阴极缓冲液,就是所谓的内阴外阳.请问这样做的目的是什么,是什么原理啊?

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在SDS－PAGE电泳中，SDS为阴离子去垢剂，带负电荷，所以电泳中一般内槽为阴极，电荷移动方向从上至下，带动蛋白分子分离。
保存时，可将内外槽电泳液分开保存，避免离子中和，影响电泳效果。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位，我的电泳最近不知出了什么问题，总是在分离胶的中上部每个孔对应的地方出现一大块的蓝色，下面是我 的一块电泳的照片
我和人讨论的初步结果是，那块可能不是蛋白质，因为它怎么脱色也不太退色，但是又是什么能跟考马斯亮蓝这样结合，而且又只在每个加样孔有，我们没想出来。

请各位帮我看看吧，我都急死了

===============================================================================================

两个问题，一是背景太高，可能是你的脱色液的问题，换下试试；二是你的上样量太高，你的蛋白条带太浓，建议降低上样量试试。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下楼主，我现在的胶浓度是7.5％，浓缩胶是5％的，每次跑电泳的时候在分离胶里面都跑的特别快，我用了100v的电压，每次的电流大概是18mA左右，本来应该要跑5-6个小时的，但是每次跑2-3个小时，溴芬兰就全部到达了底部，我用的是预染的marker，在分离胶上看得到分离出来的条带，有6条的样子，但是为什么总是跑的这么快呢？对实验结果会有什么样的影响呢？

=====================

正常现象，没什么影响。
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发表于 2013-6-27 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教楼主：我要从SDS-PAGE胶中回收蛋白亚基，是考染后再切胶回收吗？
那样考马斯亮蓝能从蛋白上除去吗？还有SDS用不用除去，蛋白亚基用不用复性？我是要回收蛋白亚基，然后制抗体，我认为考马斯亮蓝和SDS可能会影响亚基的抗原性的，所以要从蛋白上除去。
望不吝赐教

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可跑多条泳道后，然后染色当中一个泳道，再对照切除其他泳道的蛋白条带。如果直接免疫考马斯亮蓝没什么太大影响，但SDS肯定有影响，是蛋白变性，可提取后复性试试，不过产量就可能很低了。
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发表于 2013-6-27 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教个问题：我做WB的时候，每次洗出来的片背景都很黑，ACTIN又会好一点，有时候能够做到没有背景。但是做其他蛋白的时候就不行了，打开暗盒的时候多次看到整张膜上都有荧光，洗出来以后虽然能看到条带，但是背景就是不行！暂时还没有找到原因，能帮忙分析一下吗？谢谢
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教个问题：我做WB的时候，每次洗出来的片背景都很黑，ACTIN又会好一点，有时候能够做到没有背景。但是做其他蛋白的时候就不行了，打开暗盒的时候多次看到整张膜上都有荧光，洗出来以后虽然能看到条带，但是背景就是不行！暂时还没有找到原因，能帮忙分析一下吗？谢谢

===========================

是不是抗体的问题，再摸摸条件吧！
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发表于 2013-6-27 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近我用10%的胶跑蛋白，Marker中的14.4KD的一条总是不见了，而用12%的胶跑的话，Marker却是正常的，开始我以为是跑丢了，所以我二次跑的时候就在指示剂胶还有大约2cm的时候就停下来了，却依然没见14.4KD的条带，这是什么原因造成的呢？谢谢！非常急！
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大海啊故乡[使用道具]
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 小中大

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发表于 2013-6-27 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主厉害，受益非浅！
有点建议：
在主帖中有这么一段：。。。形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。。。

从这段话中，我总理解为应该大分子带负电荷多，走得快。是否修正一下。
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