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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zranqi_1 于 2013-6-27 15:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢搂主的精彩整理！从中学到很多东西。

我有一个问题：我们的电泳用的是恒流：20mA，需要大约8个小时，才能结束，正常吗？临近实验室的用恒压，一般都2、3个小时就结束了。

电泳缓冲液是否应当调整pH值？分子克隆上说的是8.3 ，但是 ...

要8个小时确实有点长了，我一般用恒压，浓缩胶50-80v，分离胶100-120v，最多3－4h。
一般pH是要调的，不过我们实验室直接按分子克隆上的配方配过后，直接用效果也挺好的。
不过影响电泳速度主要有两个原因，一个是电压或电流，还有一个是离子浓度，所以你可着重在这两方面找原因。比如你可以增加你的电压或电流试试！若还有问题，可上来跟贴！
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发表于 2013-6-27 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主，搞这个讨论版。我这段时间长期跑SDS-PAGE，遇到很多问题。想问一下waynepionnet ，恒压和恒流跑出的胶有没有差别。
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发表于 2013-6-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼主的帖子，受益匪浅。请教一个关于蛋白质降解的问题，按照您的说法，如果用诱导表达后直接收菌加buffer上样电泳，蛋白质是不是就不会被蛋白酶降解（在保证pH值的情况下）？那么超声破菌之后再煮沸上样会不会降解？因为感觉超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这一过程是否对蛋白有影响？谢谢啦
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发表于 2013-6-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主精彩的总结。但是其中有一个地方不是很妥当。
十二烷基硫酸钠（sod.dodecyl sulfate,简写为SDS）,又称月桂基硫酸钠
（sod.lauryl sulfate,简写为SLS），其分子式为CH3(CH2)10CH2OSONa；分子量为288.38。
十二烷基磺酸钠（sod.dodecyl sulfonate,简写亦为SDS）,分子式为CH3(CH2)10
CH2SONa；分子量为272.38。这两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂，而十二烷基磺酸钠因其制造及性能上的一些缺点，几乎没有在医学、生物学实验室使用。我国的《化学试剂国内外标准手册》以及国外著名试剂公司如Sigma,Aldrich和Fluka等的产品目录也都没有收载。目前常见的错误是，将本该是十二烷基硫酸钠的说成是十二烷基磺酸钠。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室用的是稳压，用的挺好，也有用稳流的，效果也不错。个人认为这只是习惯问题，就看你个人喜好了，跑电泳这不是主要问题，关键是看它的大小，是不是与你胶的长度相适应。具体可参照分子克隆上关于蛋白质电泳部分的论述。
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发表于 2013-6-27 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、用诱导表达后直接收菌加buffer上样电泳，没有问题的，不会降解。
2、那么超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这个会让蛋白质降解，所以在超声时一般洗脱液中都添加蛋白酶抑制剂，所以不用太担心这个问题。至于煮沸是不会让蛋白降解的。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
变性电泳中，蛋白质大小比预测的大的多是怎么回事？预测35kD,跑出来却是50几kD！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2013-6-27 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
变性电泳中，蛋白质大小比预测的大的多是怎么回事？预测35kD,跑出来却是50几kD！

你跑的是什么蛋白呢？可以把你的图贴上来看看吗？
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1为诱导前，2为诱导后，3为Marker；依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4抗kD。312个aa，不是天然蛋白，是人工蛋白。


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2013-6-27 15:51
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上：
你用什么载体表达的，你有没有把载体蛋白得分子量算上？
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