蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 521  3/53 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
21

发表于 2013-6-27 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #20 ukonptp 的帖子

载体是pBV220，没有带标签的。测了N端15个aa，结果正确。
顶部
uaubc[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107981
精华 0
积分 451
帖子 562
信誉分 100
可用分 3661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
22

发表于 2013-6-27 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主,我用镍柱纯化蛋白后上样,为什么会出现很长时间都不出加样孔的问题
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
23

发表于 2013-6-27 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 uaubc 于 2013-6-27 15:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主,我用镍柱纯化蛋白后上样,为什么会出现很长时间都不出加样孔的问题

1。看看电泳槽组装是否正确，比如橡皮条是否去掉，内外槽是否装配正确？
2。没有问题的话，就要看看浓缩胶是否浓度大了（不过应该是可以看到溴芬蓝下来的），或缓冲液的问题（重配一下看看）。
顶部
131415[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74126
精华 0
积分 565
帖子 789
信誉分 100
可用分 4798
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
24

发表于 2013-6-27 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想请问一下楼主，你说在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）。所说的还原剂是什么呢？
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
25

发表于 2013-6-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

1 .sds-page蛋白空间结构被破坏,这样切下的胶再跑水平电泳回收后直接免疫动物做单抗,它的免疫原性还能存在吗?

2.考马斯亮蓝整个胶染色后切胶带水平电泳,考马斯亮蓝对蛋白活性,抗原性,免疫原性可有影响?

3.想提取蛋白做单抗,可否有更好的方法?

请各位大侠帮帮忙解答,急!
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
26

发表于 2013-6-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 junhun 于 2013-6-27 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

1 .sds-page蛋白空间结构被破坏,这样切下的胶再跑水平电泳回收后直接免疫动物做单抗,它的免疫原性 ...

1、不错，如果是变性SDS－page电泳，蛋白的构像是被破坏了的，变成了线性构像。这样的蛋白仍然具有免疫原性，不过产生的抗体是针对线性表位的，而不是天然构像的表位。
2、考马斯亮蓝本身对蛋白免疫原性没有影响。
3、不知道你要提取的蛋白是什么蛋白质，如果是表达的蛋白，一般前面可加His或GST标签，用相应的商品化亲和层析柱层析。
顶部
www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
27

发表于 2013-6-27 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问配好的胶在室温放置时要不要泡到电泳缓冲液里面？
顶部
purrr[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
28

发表于 2013-6-27 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问版主,
质粒转化成功,转化后有单菌落,培养后做电泳没有目标条带.也就是目标蛋白没有表达, 会不会是电泳做的有问题啊?SDS都能将蛋白溶解吗?
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
29

发表于 2013-6-27 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问配好的胶在室温放置时要不要泡到电泳缓冲液里面？

===========================================================================================================

最好不要这样，因为电泳本身是依靠pH不同而形成的电场强弱不同把蛋白浓缩然后再分开的。把胶直接泡在缓冲液中，可能导致制胶（浓缩胶和分离胶）缓冲液环境与外界电泳缓冲液相互渗透，使内外离子强度和pH趋于一致，而不能形成分离蛋白所需要的电场。
可以用蒸馏水灌满加样孔，放置室温下，1周内没有问题，不过最好不要让你的加样孔的胶干了。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
30

发表于 2013-6-27 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质粒转化成功,转化后有单菌落,培养后做电泳没有目标条带.也就是目标蛋白没有表达, 会不会是电泳做的有问题啊?SDS都能将蛋白溶解吗?

===========================================================================================================

SDS－page电泳是检测方法，它可以检测有没有相应的目标蛋白。从你的描述来看，如果你的质粒构建和转化都是非常成功的话（比如你转化后的菌液PCR是否有目标条带，你构建的质粒的目的基因序列是否正确），SDS－page电泳检测如果没有目标条带，那么可以判断是你所选的基因片段在当前载体里不表达。
至于你说电泳本身有没有问题，你可以看看你的MARKER跑的是否正常啊，或者再跑个别人的阳性品，看看分子量大小显示是否正确。如果一切正常，那么你的电泳系统应该是正常的。不放心的话，可以贴上来看看。
SDS前面说过是一种离子型去垢剂，它可以使蛋白质分子中的氢键打开，中和蛋白分子所带的电荷，DTT或B巯基乙醇是还原剂，破坏二硫键，也只是破坏蛋白分子的高级结构，所以不存在融解蛋白质的问题。
顶部
 521  3/53 ‹‹12345678910›››|