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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

gogo[使用道具]
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发表于 2013-6-27 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助各位高手，不知有没有人做过5kD以下的小肽的电泳，请问样品的处理有什么好的方法？
我用Tris-Tricine电泳方法，把样品混在2*Tricine样品缓冲液里，40度处理1小时，但是处理后放置室温20度左右，出现沉淀，不知该怎么办，大家有没有什么好方法？
另外电泳结果目的条带有拖尾如下图，有什么好方法解决


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2013-6-27 16:00
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-27 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主，搞这个讨论版。我这段时间长期跑SDS-PAGE，遇到很多问题。想问一下waynepionnet ，恒压和恒流跑出的胶有没有差别。

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原理上讲是没有区别的，但实际应用上个人认为还是有一些区别的。恒压电泳的过程中电流是不断减小的，也就是越跑越慢；而恒流电泳的过程中电压是不断变大的，也就是越跑越快。用恒压的可能分辨更好一些，因为刚开始浓缩的时候快一些不要紧，进分离胶后随着电泳进程电流逐渐下降，可以将蛋白较好的进行分离，减少弥散，而恒流的过程恰好相反(个人猜测，没做过比较)。我们实验室都跑恒压。
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发表于 2013-6-27 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像不对吧？
恒压下，电场强度不变，迁移速度是不变的，不是越跑越慢！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助各位高手，不知有没有人做过5kD以下的小肽的电泳，请问样品的处理有什么好的方法？
我用Tris-Tricine电泳方法，把样品混在2*Tricine样品缓冲液里，40度处理1小时，但是处理后放置室温20度左右，出现沉淀，不知该怎么办，大家有没有什么好方法？
另外电泳结果目的条带有拖尾如下图，有什么好方法解决

=====================================================================================

对于低分子量的蛋白凝胶电泳，可适当加些尿素（8M），一来可以促进样品的融解，二来也可以提高凝胶的分辨率。
电泳中出现的拖尾现象也主要是由于样品溶解不佳引起的，可在处理后离心取上清上样。
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one[使用道具]
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发表于 2013-6-27 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我的目的蛋白溶解性很好，可能是SDS沉淀，上样BUFFER中8%的SDS
请问降低上样BUFFER中的SDS对电泳有影响吗，我做Tricine-SDS-PAGE电泳。
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发表于 2013-6-27 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 one 于 2013-6-27 16:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢，我的目的蛋白溶解性很好，可能是SDS沉淀，上样BUFFER中8%的SDS
请问降低上样BUFFER中的SDS对电泳有影响吗，我做Tricine-SDS-PAGE电泳。

没有影响，8%确实有点高，可适当降低点。
如果是SDS结晶的话，对电泳是没有影响的，可以离心后取上清上样即可！
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发表于 2013-6-27 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问一下，我是第一天做细菌诱导，第二天做SDS-PAGE电泳，第一天诱导完之后的细菌应该放4度，－20度，还是室温保存？跑完电泳后剩余样品想保存，又应该保存于多少度？温度对蛋白的降解有什么影响？我是新手，望各位大侠指教！感激不尽！
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发表于 2013-6-27 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

文献上说，一般跑恒压的时候，浓缩胶跑较低的电压（如60V左右），分离胶跑较高的电压（如100V左右）．我这样跑效果不好．后来摸索着反过来，浓缩胶跑100V，分离胶跑60V，反而效果很好，这是为什么？
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发表于 2013-6-27 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天转膜的时候没有转完全，因为用预染marker了，胶上还有预染marker的条带，条件是以前一样的条件，为什么只转了一部分呢？我用的是biorad的半干转，80mA，2h，在转的过程中，我发现电压好像没有太大变化，我当时还挺纳闷的，是不是短路了？如果这样的话应该应该一点也转不到膜上啊，还是时间不够长，以前都是这个条件，也都转上去了，可这次为什么呢？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-27 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我是第一天做细菌诱导，第二天做SDS-PAGE电泳，第一天诱导完之后的细菌应该放4度，－20度，还是室温保存？跑完电泳后剩余样品想保存，又应该保存于多少度？温度对蛋白的降解有什么影响？我是新手，望各位大侠指教！感激不尽！

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细菌诱导完后可放4c就行了，此时细菌几乎不生长。不要放在室温。
电泳多余的样品如果段时间内就用的话，可放4c，时间长的话可放－20c保存。
蛋白的降解与温度没有直接的关系，只不过在适当的温度下，促进蛋白质降解的水解酶活力高，可导致蛋白的降解。
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