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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

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发表于 2013-6-28 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

tricine－sds尿素，跑浓缩胶稳压１５０v，开始电流４０mＡ
（８＊１０cm两板）电流逐渐变小，一个小时后，只有１０mＡ，这算正常吗．
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发表于 2013-6-28 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问我跑SDS-PAGE时泳道之间总是相互影响很大,甚至完全偏向另一泳道,这是什么原因,我跑的胶为15%的分离胶,样品已经利用Tris-HCl(8.0,0.05M)透析处理,谢谢.
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发表于 2013-6-28 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好，我现在要做分子量4KD的蛋白的SDS-PAGE，这是我的电泳图，，溴酚蓝已经跑到了板底，不知道是什么原因，左边marker下面的两条带看不到，右边是我的样品，大家能不能帮我分析一下，优化一下条件呀，一个星期了总是不成功，另外我的上样量10ug，是不是少了？


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发表于 2013-6-28 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的应该是电泳时间比较长，小分子的蛋白跑到最后扩散了，所以看不见最后2条带了。建议溴酚蓝跑到电泳胶的中间偏下一点就可以了。
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发表于 2013-6-28 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
tricine－sds尿素，跑浓缩胶稳压１５０v，开始电流４０mＡ
（８＊１０cm两板）电流逐渐变小，一个小时后，只有１０mＡ，这算正常吗．

=================================================================================

电泳时，电流出现一些变化，一般是正常的，检查一下是否影响您的实验结果，如果没什么影响，可以不用管它。
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发表于 2013-6-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问我跑SDS-PAGE时泳道之间总是相互影响很大,甚至完全偏向另一泳道,这是什么原因,我跑的胶为15%的分离胶,样品已经利用Tris-HCl(8.0,0.05M)透析处理,谢谢.

======================================

胶不均匀，或样品浓度差别过大，可导致泳道变形
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发表于 2013-6-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我现在要做分子量4KD的蛋白的SDS-PAGE，这是我的电泳图，，溴酚蓝已经跑到了板底，不知道是什么原因，左边marker下面的两条带看不到，右边是我的样品，大家能不能帮我分析一下，优化一下条件呀，一个星期了总是不成功，另外我的上样量10ug，是不是少了？

===================================================

带靠的太紧了，与分离胶浓度过高有关，可调低一点分离胶浓度试试！
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发表于 2013-6-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景太浓：
最近一段时间做western ，发现压片后背景色很浓，以前的条件（那时基本没有背景）与现在做的一样（一抗二抗的比例），封闭的时间足够长，洗膜是10min×4次，可是总是发现背景很深，也不知是什么缘故，会不会是提蛋白过程出现问题，还是洗膜的时间不够长？
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发表于 2013-6-28 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主！我想问个转膜的问题，我做的蛋白分子量100KD左右，用200mA电流转100min，这样行不？我看人家的marker转过来好像比我浓，还有封闭时一般需封闭多少时间？
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发表于 2013-6-28 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好，我在做一个19KD左右的目的蛋白，用12%的胶跑的，但每次跑胶的时候溴芬兰跑进分离胶一厘米后就开始变的有点弥散了，开始怀疑是我的胶的问题，后来用别人的胶跑也是这样的情况。不过MARKER跑的还是可以，染胶后跑的结果也还过的去，不过一直还是没做出我的目的条带，不知道是转膜的原因还是其他，总是在50KD左右出现一条比较亮的非目的条带，而且背景比较干净，我现在都开始怀疑我的抗体了。希望楼主能给小弟提点建议，我现在真的急啊！！！
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