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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

yes4[使用道具]
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我没有做过动物的,我做的是植物蛋白的PAGE,(1)上样量跟你所用的胶的大小有关吧,想BIO-RAD mini型的最大上样量也就是25微升。PAGE胶是非变性胶,所以上样缓冲液里不加SDS,其余的同SDS-PAGE(2)只要你的梳子孔够大可以加大上样量吧(3)你可以用考马斯亮蓝染一个泳道的,然后剩下的胶和它对照着切,要是都染了的话我认为应该有影响吧
剩下的那两个问题我就不知道了,呵呵
这些是我的一些观点,我也是个跑电泳的新手吧,不知道这些问题解答的怎么样,呵呵
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ero11[使用道具]
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我现在在是把胶直接切下来(其中一条带and marker用考马斯亮兰蓝色,对准后切胶,染色后的胶会缩小一点。)放入1.5mlE管中,加入约700ul的PBS捣碎,用封口膜将口封住,再把它们放在4度冰箱里的脱色摇床上快速振荡(230/分),12h和24h后分别收样,走电泳,看效果。
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wu11998866[使用道具]
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我是新手,我的蛋白是120KD,用7.5%分离胶,5%积层胶,转膜时9V恒压半干转3小时,转完考染发现所有蛋白都没转过去,请各位不吝指教 。
注:我实验室只有一个仪器,输出电压恒定,不能调整
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idea2011[使用道具]
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我的课题是纯化一个真菌产的膜结合的酶蛋白,这个蛋白的疏水性比较强,离子性较弱。为了维持蛋白的活性, 我在缓冲液中加了0.1%的非离子型表面活性剂(Triton X-100)。如果缓冲液里不加表面活性剂,那么目的蛋白在缓冲液中的溶解度非常低,超滤浓缩时甚至有部分目的蛋白会析出。表面活性剂的存在对蛋白的纯化没有影响,但是在SDS-PAGE分析中却出现了问题。
这几次在蛋白电泳分析时都出现了同样的现象---胶上的条带非常非常不清楚。SDS-PAGE分离胶的浓度是12.5%,浓缩胶的浓度是5%。据我个人分析,应该是表面活性剂起了一定的干扰作用,因为在SDS——PAGE上样前,我把较纯的蛋白冻干浓缩了10-20倍(如果不浓缩,那么蛋白量达不到显色的要求),这样表面活性剂业随着浓缩了10-20倍,即表面活性剂的浓度变成1%-2%。
有资料报道说应该在电泳A液中加少量的Triton X-100,但是绝大多数的报道并没有提到有什么特殊的处理步骤。
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ROSE李[使用道具]
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我最近在做脑组织的P-CREB的western blotting
提样方法是直接用1乘的SDS上样缓冲液,按1:10的体积加,之后超声裂解10s,而后直接沸水煮沸后,10000g离心5min,之后上样,结果条带很散,后来每次上样之前10000g离心5min,发现底部有沉淀,再上样跑了一次,发现好了一点,之后再这样重复,条带总是很丑,很难看。
我自己分析可能离心时间和速度不够,毕竟是组织的,杂质较多,导致条带很丑,因为一般组织的离心都15000转,10-20min左右。第二个在一乘的上样缓冲液中加入一些氟化钠,原钒酸钠,蛋白酶抑制剂。请各位指教一下。
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bamboo16[使用道具]
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我是新手,我想请教几个问题:

1、我做的是膜蛋白,其片段从20kd到100kd都有,请问15%的的分离胶能行吗?因为我的Marker是宽分子量的,6kd~200kd。

2、前辈们有直接用菌体蛋白来跑SDS的吗? 可以给点经验之谈吗,例如怎么处理样品、上样量多少合适之类的。。

3、能把胶上的目的条带切下来直接去功毒吗?如果可以,具体的方法能传授一下吗 ?
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bamboo16[使用道具]
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今天不知道怎么回事,前两天都能用的样品,今天上样时怎么也沉不到孔底,,是怎么回事啊。。是不是我冻融了两三次的原因?有什么办法没有啊?加甘油行不行? 
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redbutterfly[使用道具]
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谢谢楼主整理的资料和精心的解答
我也有一个问题:现在我做的胶总是出现皱眉”(两边向下中间鼓起)现象,您说是两板之间的底部间隙气泡未排除干净,可以可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。我想知道,在灌胶之前先把缓冲液加入然后就开始灌胶,不能再把缓冲液倒掉,是这样的吗?
Thank you very much!
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3648755[使用道具]
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在调电极缓冲液时加入很多NAOH才调到8.3,过多的NAOH对跑胶有影响吗
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any333[使用道具]
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请问:我最近跑sds-page 溴酚蓝条带和蛋白带很接近,有的甚至在溴酚蓝条带的前面,是何原因呢?
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