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标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

duoduo[使用道具]
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没有关系,该加多少就加多少,关键是浓缩胶缓冲液的pH调整到6.8,这很关键,每次调pH时,注意校正pH计。

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在调电极缓冲液时加入很多NAOH才调到8.3,过多的NAOH对跑胶有影响吗
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duoduo[使用道具]
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若您的溴酚兰跑到底了,那么就是一些小肽,分子量比溴酚兰大不了多少。
也有一种可能是玻璃板没有刷干净,玻璃表面可能带有一些蛋白,这些蛋白
可能也会跑在溴酚兰之前。另外,缓冲液最好过滤后使用。


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请问:我最近跑sds-page 溴酚蓝条带和蛋白带很接近,有的甚至在溴酚蓝条带的前面,是何原因呢?
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okhaha[使用道具]
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急问:
国产电泳仪什么牌子比较好
我们想作SDSPAGE
还有核酸蛋白接受仪什么牌子比较好阿
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vvmmoy[使用道具]
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六一厂的还可以。

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急问:
国产电泳仪什么牌子比较好
我们想作SDSPAGE
还有核酸蛋白接受仪什么牌子比较好阿
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qumm1985[使用道具]
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求助:最近做western,总是出现相邻的蛋白上样孔目的条带连成一条线的情况,左右蛋白条带之间不能看到明显的界线。电泳的梳子间距应该是足够了的。请教一下应该如何解决这个问题啊!
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youyou99[使用道具]
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虽然我做了不少SDS-PAGE,但是对其中的某些步骤还不甚了解,我的意思是说不知道有些操作的目的,比如说样品要和一定量的buffer混合这一步,有时有2×buffer(10微升样品加10微升buffer),有时用5×buffer(20微升样品加入5微升buffer),这些buffer的配置是有一定差别的,但是采用何种buffer以及加入的量有没有一个线性的关系呢?
还有一个很愚蠢的问题,请不要笑话我。变性SDS电泳的电压和电流最佳是多少,我们实验室一直采用200v,电流60mA,但是我发现好多人跑胶的电压和电流都比我们实验室用的低好多,我们实验室的操作对吗?
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ritou1985[使用道具]
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问下高手,当pr的相对分子质量小于1000时,对凝胶系统有什么特别的要求和改变。有人做过sds-尿素系统吗?
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mysmdbl[使用道具]
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求助:
原来的师姐已经在一个志贺菌株中成功表达过一个分子量58kd的蛋白,并用western blot验证过蛋白的存在。我现在把师姐冷冻的细菌重新摇起来然后做sds-page电泳。现在的问题是跑出来的蛋白条带很淡,几乎都看不清楚,包括蛋白marker也是如此
我的细菌是这样处理的:5ml菌液对数生长期后3000rpm离心5min,pbs重悬,煮沸5分钟。取10微升样品加等量2×上样缓冲液。
电泳系统:5%基层胶,12%分离胶,标准蛋白20微升直接上样,电泳缓冲液按分子克隆配置。
蛋白条带很淡已经出现四次了,依然不知道问题在哪,前几次出现的时候认为是上样的问题。现在实验室有个师姐用同样地标准蛋白和电泳缓冲系统跑出来的蛋白效果很好,很清楚。所以现在很是郁闷,已经耽误半个多月了,不能再耽误了。请教高手指点。谢了先
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langlang[使用道具]
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虽然我做了不少SDS-PAGE,但是对其中的某些步骤还不甚了解,我的意思是说不知道有些操作的目的,比如说样品要和一定量的buffer混合这一步,有时有2×buffer(10微升样品加10微升buffer),有时用5×buffer(20微升样品加入5微升buffer),这些buffer的配置是有一定差别的,但是采用何种buffer以及加入的量有没有一个线性的关系呢?
还有一个很愚蠢的问题,请不要笑话我。变性SDS电泳的电压和电流最佳是多少,我们实验室一直采用200v,电流60mA,但是我发现好多人跑胶的电压和电流都比我们实验室用的低好多,我们实验室的操作对吗?

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其实加buffer的量没有什么很严格的限制,一般配置上只是其中组分的量多少问题,最后加完了,都是把buffer变成了1×的了,一定要保证buffer是足够的,让SDS能与蛋白充分结合就好。用5×buffer只是在蛋白浓度低时能够提高你的蛋白上样量,而不至于使样品被buffer进一步稀释;如果样品浓度大的话,可以用2×buffer
SDS-PAGE的电压和电流,只要按照你们实验室的常规操作就可以了,既然你们每次做的电泳结果没有问题,还怀疑什么呢?
不同实验室的电泳槽产品质量不一样,能承受的电压等条件也不同,有的槽子不能用大电压的。
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XYZQ[使用道具]
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我前几天跑的SDS-PAGE胶的结果很奇怪。在堆积胶的底部有大片的混浊的东西,在脱色以后这些混浊虽然减轻了许多,但是这些东西究竟是什么?
我跑的蛋白样品是辛基疏水柱洗脱下来的,洗脱的缓冲液中含有0.1%的表面活性剂,收集洗脱有活力的部分然后透析除盐,再冻干浓缩了十几倍然后上样SDS-PAGE,每孔的上样量在5微克上下。经过浓缩的样品中含有2%左右地表面活性剂Triton X-100。
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