蛋白质与蛋白组学

汪家政的《蛋白实验技术》，我认为越经典的方法越实用。

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整个帖子都看了一遍，真是获益非浅啊！我有个问题请教一下：你们做SDS-PAGE时配胶的配方都是参考哪本书的？我看了几处：《分子克隆》、郭尧君《蛋白质电泳实验技术》、汪家政《蛋白质技术手册》。虽然大体意思都一样，但是配胶的方子有很大的不同呢！请问各位有经验的电泳高手，哪一种配方比较好用呢？正在困惑中！谢谢了

《分子克隆》、郭尧君《电泳实验技术》、汪家政《蛋白质技术手册》。虽然大体意思都一样，但是配胶的方子有很大的不同呢！

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哈，应该说任何一个都可以，以分子克隆为首，三个都够经典的。但不知你所说方子很大不同在何处？母液不同则方子肯定不同，但缓冲液、SDS终浓度都是一样的。AA母液的比例倒是会有点差别，结果是最佳分辨效果会有差异，但一般为29:1或29.2:0.8，上下比例都可以。Ap和TEMED两个催化所用可以根据凝胶聚合速度随意调整。

郭尧君的因为专门讲电泳，所以在原理和应用方面更加详细。你参见郭的相关章节肯定有详细叙述并可释你所疑。

谢谢各位的精彩回帖。小弟有了很大的受益！！！！
这两天做Western blot，蛋白分子量43kd，我用12％的分离较，5％的积成胶，上样量50ug，用5*loading buffer， 恒压先80V,marker分层后110V，一直跑到底， 转膜用恒流200mA，3h，脱脂牛奶封闭过夜，一抗（1：300；500；600；1000）都试过，室温摇床2h，二抗（HRP）（1：6000；7000；8000）都试过，室温摇床2h，洗都是TBS－T 15min*3，ECL时没有荧光，曝光什么都没，然后用DAB显色也是没有条带，但用丽春红染有明显条带。
请教各位： 1.我的试验过程及条件是否合适，那里需要改进？
2.我的胶跑的自认为还行，没有歪，marker的条带分的很清楚，不知到这样算不算跑胶没问题；
3.丽春红染有条带，DAB无条带，是不是我的目的蛋白没转上，或者转过了？我的首要问题是想知道我的膜上有没有我得目的蛋白，怎么可以知道啊？或者我提蛋白是没有把目的蛋白提出来？
4.会不会是一抗与目的蛋白结合的问题，或者是一抗跟二抗结合的问题，怎么排除？
5.我很菜，做了好几次都没结果，好难过，我一个人在黑暗中摸索，不知道问题出在那里，不知道该怎么尝试，郁闷，希望得到各位的帮助， 给点意见，谢谢啊！！！！

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1. 转膜用恒流200mA，3h，感觉转移时间有点长了。
2. 看跑胶有没有问题，你可以在做WB之前跑胶看看你的蛋白提出来了没有。最好是在WB时，同时跑两块板，一面用来转膜，一面用来考染。如果样品少，可以在同一块板上进行，然后切开分别操作。
3. 想知道膜上有没有目的蛋白，可以在转膜后封闭前，加立春红染色，就可以看到目标位置是否有蛋白。要知道提蛋白是否把目的蛋白提出来，只能提前进行电泳染色看看。
4. 抗体稀释问题，应该是倍比稀释，像你这种1：300；500；600；1000没有意义，可以这样比如1：200；400；800；1600，自己随便设置。
一抗和二抗的问题，你可以本版搜索一下，以前我们回答过这些问题。可以用点杂交。
5.自己一个人摸索是很郁闷，浪费时间，可以经常来本版搜索一下，有很多这方面的帖子。