蛋白质与蛋白组学

文献上说，一般跑恒压的时候，浓缩胶跑较低的电压（如60V左右），分离胶跑较高的电压（如100V左右）．我这样跑效果不好．后来摸索着反过来，浓缩胶跑100V，分离胶跑60V，反而效果很好，这是为什么？

===========================================================================================================

不知道你所说的效果很好是指什么？事实上，电压的大小不是一定的，可以根据自己的经验来确定，我有同学用120V浓缩胶和分离胶，效果都挺好。
电压或电流不能太大，我觉得可把握两点就行了：一是防止产热过高；二是防止浓缩胶中蛋白是否很好浓缩，分离胶中是否很好的分开。
在保证这两个前提下，可适当提高电压或电流，加快电泳速度。

昨天转膜的时候没有转完全，因为用预染marker了，胶上还有预染marker的条带，条件是以前一样的条件，为什么只转了一部分呢？我用的是biorad的半干转，80mA，2h，在转的过程中，我发现电压好像没有太大变化，我当时还挺纳闷的，是不是短路了？如果这样的话应该应该一点也转不到膜上啊，还是时间不够长，以前都是这个条件，也都转上去了，可这次为什么呢？

=========================================================================

很可能是偶然事件，再做做看。
如果分子量很大的话，可能转移不完全。另外膜处理的不均匀或气泡没赶尽，都会导致转膜不成功。

楼主：
您好，我现在准备做SDS-PAGE电泳，欲从小鼠脑中提取蛋白，（蛋白位于神经元胞质和树突中，15kD）我现在提取蛋白，在提取液（60mmol/l,tris-cl;25%甘油；2%SDS;14.4mmol/lB-疏基乙酸；0.1%溴酚兰）手动匀浆，然后14000rpm离心25min，取上清.
这样是否可行？
我看到别人的提取液（全细胞裂解液）是（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：PMSF 1 mmoL/L 7：Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml10:1mM PMSF11:1mMNaF)
请问这两种是否相差好大？
可否帮我提供后一种全细胞裂解液的具体配制方法？
还有一个问题：蛋白＋loading buffer 煮沸后离心的转速和时间是多少？

======================================================================

你好！提组织蛋白没做过，不敢乱说。
具体的配方就是首先你要确定配的体积，然后算出相应的摩尔数，再算出质量或体积就可以了。
我一般常用6000rpm，1min。

我的marker最后一带常与溴酚蓝重合,常看不到最后一带,是怎么回事呢

===============================================

由于两者的分子量大小相近，可能出现重合的现象，这是正常的。