蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 521  6/53 |‹‹‹45678910111213›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
51

发表于 2013-6-27 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主如果样品酸性太大对跑电泳有影响吗？

===========================================================================================================

有影响，不过要视你的酸性的强弱了。
由于制胶的缓冲液和电极缓冲液都是有一定酸碱度的，而蛋白的浓缩和分离也是要依靠这个酸碱度来实现的。所以酸碱环境的破坏会对实验结果有影响的。不过如果酸性不是很强的话，应该没有问题，可以动手试一下。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
52

发表于 2013-6-27 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
带出现纹理现象是什么现象？

======================================================

主要是样品中的大分子颗粒未去除造成的，建议离心取上清上样试试。
顶部
yueban-1147[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75776
精华 0
积分 692
帖子 1064
信誉分 100
可用分 6113
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
53

发表于 2013-6-27 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在其它条件相同情况下，我用12%分离胶可以跑现蛋白条带，而用6%分离胶却跑不出蛋白条带？　我的目的蛋白分子量为100、120KD，不知可否用12%分离胶？
顶部
is2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75851
精华 0
积分 510
帖子 680
信誉分 100
可用分 4233
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
54

发表于 2013-6-27 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回楼上：SDS-PAGE的原理是分子筛的原理，胶浓度高一些分离的效果当然好，一般情况下SDS-PAGE用的多为12％的胶，6％的胶太稀了，分离的效果自然差很多。应该说6％的胶基本没有什么分离能力。如果你想让你的目的蛋白更好的分离，如你所说的100KD和120KD，建议跑梯度胶，10-15%。
顶部
如影随形[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70421
精华 0
积分 201
帖子 142
信誉分 100
可用分 1466
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
55

发表于 2013-6-27 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回楼上：SDS-PAGE的原理是分子筛的原理，胶浓度高一些分离的效果当然好，一般情况下SDS-PAGE用的多为12％的胶，6％的胶太稀了，分离的效果自然差很多。应该说6％的胶基本没有什么分离能力。如果你想让你的目的蛋白更好的分离，如你所说的100KD和120KD，建议跑梯度胶，10- 15%。

=====================================================================================

不准确吧. 胶浓度与欲分离的分子量有关. 比如二三十K的可以选15%的胶, 而五六十K的可以选12%, 或降至10%左右.
不过说老实话, 100K, 120K的没专门跑过, 大概可以考虑用略低于10%的浓度吧.
顶部
caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
56

发表于 2013-6-27 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好！
我在跑15%的胶的时候mark的某个分子量条带处（比如在15kd处），本来是单一的条带怎么会出现挨的很进的两条呢？
顶部
owanaka[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76900
精华 0
积分 395
帖子 510
信誉分 100
可用分 3337
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
57

发表于 2013-6-27 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位群友您们好：

我是一个刚开始做试验的研究生，我现在在做Western blotting 。但是总是做不出结果来。请教您们几个比较急的问题.。

1、我做的蛋白是从小鼠脑组织抽取的，分子量是15－17Kb。

2、但是曝光显影总是没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。

3、下面是我做的试验方法步骤。

非常感谢您们

盼回

第一天：

脑组织蛋白的抽取：

⑴ 取小鼠脑组织 ～200mg加2ml全细胞裂解液（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：1％蛋白酶抑制剂）手动冰上快速匀浆。
⑵ 14000rpm离心40min
⑶ 上清即为抽取的蛋白，吸出分装，进行定量。（-20℃保存）

电泳

制备聚丙烯酰胺凝胶：

1、 SDS-PAGE 15%胶的配制

30％丙烯酰胺 (ml) 4.0

4 X resolving (ml) 2

ddH2O (ml) 2

10%AP (μl) 40~~~~~~~~~~~~~~80

2、 混匀后小心将分离胶注入准备好的玻璃板中，到达第一条横线。

3、 封胶

4、 待胶凝后将封胶液倒掉。

5、 配制5％浓缩胶：插入梳子，室温下放置1小时左右。

5％浓缩胶

30％丙烯酰胺 (ml) 0.35

4 X stacking (ml) 0.75

ddH2O (ml) 1.97

10%AP (μl) 20~~~~~30

6、 灌好浓缩胶后1h拔除梳子。
顶部
owanaka[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76900
精华 0
积分 395
帖子 510
信誉分 100
可用分 3337
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
58

发表于 2013-6-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
7、 加样

1）、小心移去梳子，将凝胶电泳板放入电泳槽，用夹子夹紧，然后在上下电泳槽中分别加入电泳缓冲液（running buffer）并使上槽缓冲液浸没胶面。

2）、上样前将胶板下的气泡赶走。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加20μl事先制备好的样品，（对于0.15cm厚的胶最哆加15 μl样品）样品一般在1.0mm厚的胶 加样50-100ug/lane)。。

3）、电泳：预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质， 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。接通电源，电压120－130V，当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
1、电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：剪一块与胶大小一致的Hybond－P 膜，在甲醇中泡10 秒钟，再在转移buffer(transfer buffer)中浸泡10分钟，同时切下的胶也在转移buffer(transfer buffer)中浸泡一会儿然后按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(transfer buffer)。转膜时在冰块中进行。

2、100V恒压转膜2小时左右。

3、膜用塑料盒装好，加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）封好盒子。室温摇床孵育30min。

4、倒掉封闭液，加入一抗4℃过夜。

第二天

1、将膜用Washing buffer洗20分钟X 3。

2、将膜放入塑料盒中，加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：1000）,封好盒子。室温摇床孵育1小时。

3、Washing buffer洗20分钟X 3。

4、PBS洗几次

5、在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上包好显影（避光进行）。
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
59

发表于 2013-6-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好贴，顶！
顺便问一下楼主，我的电泳条带为什么呈纺锤形呢？染色后条带呼啦拉一大片，看不清楚？

===========================================================================================================

我跑PAGE的时候也出现过这种事情， 除了跑的时候在浓缩胶和分离胶中的电压要控制好以外， 是不是可以再检查一下你的浓缩胶和分离胶中的Buffer的PH值是不是配的相当精确， 误差要在0.2之内。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
60

发表于 2013-6-27 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在其它条件相同情况下，我用12%分离胶可以跑现蛋白条带，而用6%分离胶却跑不出蛋白条带？　我的目的蛋白分子量为100、120KD，不知可否用12%分离胶？

==========================================================================================================

曾跑过大分子量蛋白的电泳，应该不需要6％的胶来做，5％的浓缩胶，10％左右的分离胶应该可以满足要求了。选择多大的胶主要还是要以能否分离出目的蛋白为准，可以在电泳后把分离胶和浓缩胶同时染色，看是否有蛋白留在浓缩胶中。
顶部
 521  6/53 |‹‹‹45678910111213›››|