蛋白质与蛋白组学

谢谢指点。我用6%、8%、10%、12%分离胶试过。6%分离胶只见一条竖的蛋白痕迹，8%的在一条竖的蛋白痕迹中可见一条横带，10%的在一条竖的蛋白痕迹中可见三条横带，12%可见分离清楚的横条带。不知何原因。

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胶的浓度过低时，其分子筛作用不明显，因而不能有效分离蛋白，会出现类似于拖带的情况。

想问一下关于样品缓冲液得问题，请指教。
我看到有好几种不同得样品缓冲液：5x，6x，还有2x的，这些数字指的什么东西的浓度呢？在植物材料上用那种好些？另外，在样品缓冲液中，用巯基乙醇的作用和DTT的作用是完全一样的么？在量上面有什么区别？
我想配一个6x的样品缓冲液，成分是这样的（总体积约36ml）：
1.5 M tris-Hcl（PH6.8） 6ml
β-巯基乙醇 10.8ml
甘油 18ml
10%SDS 3.6g
溴芬蓝 少量
这样配出来的好象不是兰色的，是金黄色（偏红），因为以前用人家配好的是兰色的，所以，不知道是否在配的过程中还要注意什么问题了？
PS： 这个方法是从同学那边抄来的，所以还不一定正确。

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5×、6×或者别的比例，主要是指当中的除水外的有效成分与1×sample loading buffer的比例，试验中如果样品中的蛋白浓度不是很低的话，不主张用高倍比的buffer，正如dimocarpus战友所说，计算不方便，常用的有1×、2×，可参考一下dimocarpus战友的配方。
植物材料用这个配方也是没有问题的。
在sample loading buffer中，DTT和B－巯基乙醇的作用是相同的，都是起到还原的作用，就是将蛋白分子的二硫键打开，然后结合自身所带的－SH，使蛋白的高级结构被破坏。
相比较而言，DTT的气味和毒性都要小的多，而在作用上更有效些，一般DTT在比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近（不一定适用于SDS-PAGE），但DTT价格略高一些。
DTT一般放在－20c保存，不能高压。
你所说的溴酚蓝金黄色是由于你的pH没调好导致的，需在没加溴酚蓝之前，将缓冲液的pH调到6.8，必须要准，否则在碱性的情况下会出现你所说的问题。

请教各位大侠，小妹正在做WB,以前跑的SDS-PAGE电泳条带非常清晰，而同样的条件只是试剂重配过了，最近的效果却很差，条带总有点模糊感，而且分离胶15％按《分子克隆》上的配方，过硫酸胺(都是现配现用)的量都加倍到0.30ML,TEMED也是0.30ML胶才凝,这么多的催化剂和加速剂是否会影响分辨效率?我的目标蛋白是45KD和30KD,浓缩胶是5%的,请教我怎样解决胶不凝的情况,怎样提高我的分辨效率?

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单体没有问题的话我个人倾向于认为AP有点问题。我最近也碰到这个问题，AP容易潮解，可能容易变质。配的时候要充分的混匀。AP和TEMED不能加得太多，尤其是TEMED不能加太多。一般胶凝固时间以1h左右为好。加太多胶凝固太快，凝固的不均匀，分辨率会受到很大的影响，而且，胶凝固太快的话，像Marker等可能就会有“鬼带”出现，也就是某些条带下面会多出一两条条带。15％的胶跑30和45KD的蛋白应该可以了，注意跑的时候电压不要太高，不要跑太快，如果还想要提高分辨率的话，推荐跑梯度胶，10－17.5％，但是要小心，浓度太高胶很脆，剥胶的时候别剥破了。

请教各位大侠，小妹正在做WB,以前跑的SDS-PAGE电泳条带非常清晰，而同样的条件只是试剂重配过了，最近的效果却很差，条带总有点模糊感，而且分离胶15％按《分子克隆》上的配方，过硫酸胺(都是现配现用)的量都加倍到0.30ML,TEMED也是0.30ML胶才凝,这么多的催化剂和加速剂是否会影响分辨效率?我的目标蛋白是45KD和30KD,浓缩胶是5%的,请教我怎样解决胶不凝的情况,怎样提高我的分辨效率?

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不凝的问题可能主要是：1、温度，温度太低，凝固的速度慢或不凝，可放在37C温箱中孵育；2、AP和TEMED，一般情况下，这二者是不太容易出现问题的，虽然说AP容易失效，但我的经验曾用过4C冰箱中保存半年的10%AP,也没有问题。不过可换下试试。3、如果30％丙稀酰铵换过，可能是这个问题，如果丙稀酰铵不纯的话，可能在胶鳌合时，效果不好。
条带模糊可能与你的胶凝固不好有关，可适当降低凝胶浓度看看，用12％凝胶看看。

我跑的细胞浓缩上清液，可是等跑完之后发现什么都没有，而且样品还严重的影响MARKER的条带，即MARKER都跑斜了还不清楚，请问这是怎么回事啊？

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什么都没有，可能是你的样品蛋白浓度太低或根本就没有蛋白。Marker能跑出来，说明你的系统是没有问题的。跑斜了，也不一定是样品蛋白影响的，可能是玻璃板底部的气泡引起的。

我跑的细胞浓缩上清液，可是等跑完之后发现什么都没有，而且样品还严重的影响MARKER的条带，即MARKER都跑斜了还不清楚，请问这是怎么回事啊？

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你的上清液里是不是盐浓度很高啊，如果很高的话是会影响到边上泳道的电泳的。