蛋白质与蛋白组学

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

(1)为什么会出现两条带

===========================================================================================================

应该是最底部的两条带吧，这应该是因为你切胶时没有很准确的切下目的条带，而把相邻的条带也切下来的缘故，可以同时多个泳道跑电泳，然后快速染色一个泳道，对照这个位置切余下的胶，不过要十分准确的切胶，这就与你电泳时是否位置一致有关了。

请教几个问题：
我买的天为时代的蛋白marker，取10ul直接上样就行，不用再加loading buffer
但我的样品用的上样buffer和它marker的好像不协调，跑浓缩胶的时候，marker的前沿迟迟不动 ，这样前沿挺难看，后来才渐渐齐了，但跑出来的不好看。不同的buffer是否对电泳有影响？
我是浓缩胶80v，分离胶120v，0.75mm的胶两块，bio-rad的电泳槽
上面两个是我跑的，带总是会变宽或窄，带会不一样宽，很难看
下面两个是我从园子里看别人发的，
怎么才能跑到他们那么漂亮呢？
我觉得自己做胶到上样都挺好。
电极那金属线稍微有一点点弯 是否会影响前沿的水平呢？

还有我按1gR250 450ML乙醇 450ml水 100ml醋酸配染液，胶缩得好小 好小了

===========================================================================================================

不知道你加样的时候是怎么加的？看起来好像是样品扩散造成的，建议检查一下是否是加样时间过长和加样泳道两边的泳道为空泳道（如果是，可以用上样buffer加一下，防止样品对周围扩散）。
上样buffer应该都是大同小异的，不会对电泳产生影响。
金属线弯一点没事的。
染色液也没有问题，胶变得小也是正常的，主要是在染色过程中失水引起的，可在脱色后用水浸泡一下就可以了。

想问一下上样量的问题，走SDS-PAGE时必须保证每个上样孔的上样体积（样品加loading buffer)都一样吗？可是每个样品的蛋白浓度都是不同的，如果要保证每个孔的蛋白含量一致（例如100ug），相应的所上样品的体积就不同，再按1：1加loading buffer就很难让每个孔的总体积都一样呀，可不可以用loading buffer补足体积，而不按比例加laoding buffer，我正要做western-blot，没什么经验，希望大侠们多指点，不胜感激！

===========================================================================================================

不需要体积都相同，有时为了比较浓度的不同，可以按同样比例稀释样品，然后同样体积的样品，但如果你是为了保证条带的一致性，可计算好同等蛋白量的体积就可以了。loading buffer主要是使蛋白变性的作用，其中的sds和DTT一般都是过量的，肯定可以满足上样蛋白的需要，如果不放心可适当多加点，但最终计算好你加了多少蛋白量就可以了，做weston之前最好摸索一下电泳条件再做。

不知道你加样的时候是怎么加的？看起来好像是样品扩散造成的，建议检查一下是否是加样时间过长和加样泳道两边的泳道为空泳道（如果是，可以用上样buffer加一下，防止样品对周围扩散）。
上样buffer应该都是大同小异的，不会对电泳产生影响。
金属线弯一点没事的。
染色液也没有问题，胶变得小也是正常的，主要是在染色过程中失水引起的，可在脱色后用水浸泡一下就可以了。

========================================================

谢谢 你解除我一些疑惑
加样就是用10ul的枪，加完自我感觉挺漂亮，也没串孔，没有很长时间吧，
一个样一枪。空泳道也加了buffer的。
你看我的样品带比marker带宽了好多，真难看阿，都像marker带就好了，
虽然宽，但又好像没超过那个孔的范围，我用的10孔的，只用中间几个孔，
急需跑出漂亮的带 要毕业了阿
我也不知道该注意什么了，样品就是TCA沉淀的酵母培养上清，
顺便问一下，DOC-TCA中，0.15%的DOC怎么配，用水么？

谢谢 你解除我一些疑惑
加样就是用10ul的枪，加完自我感觉挺漂亮，也没串孔，没有很长时间吧，
一个样一枪。空泳道也加了buffer的。
你看我的样品带比marker带宽了好多，真难看阿，都像marker带就好了，
虽然宽，但又好像没超过那个孔的范围，我用的10孔的，只用中间几个孔，
急需跑出漂亮的带 要毕业了阿
我也不知道该注意什么了，样品就是TCA沉淀的酵母培养上清，
顺便问一下，DOC-TCA中，0.15%的DOC怎么配，用水么？

============================

可在你的上样buffer中加些甘油试试。
doc－tca没做过。