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标题:【转帖】总结western blot经验

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我有一个疑问:
加入ECL试剂之后,我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干,然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中,然后关上系统箱子的门,在电脑屏幕上点击scan按钮,显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思?
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Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)
7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存

这里德两个PMSF溶液没搞懂

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PMSF很难溶于水,用异丙醇来溶解
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any333[使用道具]
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我有一个疑问:
加入ECL试剂之后,我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干,然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中,然后关上系统箱子的门,在电脑屏幕上点击scan按钮,显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思?

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是说最后的曝光在什么设备里,你用的是一种,还有一种就是用一个暗匣,把胶片放到里面去,盖上暗匣的盖子就可以曝光了,二者的作用都是一样的吧,不知说的对不对。
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我有一个疑问:
加入ECL试剂之后,我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干,然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中,然后关上系统箱子的门,在电脑屏幕上点击scan按钮,显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思?

===============================================================

你们这是荧光可以自动曝光的。我们做压片的,是没有这设备,只能黑屋子里摸索了。
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wmp1234[使用道具]
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我正在学习western,请问各位高手,在做组织蛋白western时,用的梳子是多大的啊?宽的和窄的对跑出来的条带弥散有差别吗?还有上样量的选择,若目的条带表达弱,该怎么权衡弥散和上样量的关系啊??我用的是1mm的10个道宽梳子,上样20ul,蛋白浓度在20mg/ml,出来的内参条带弥散差不多成一条明亮的线,而目的条带还算轮廓清楚就是稍有点弱。我师兄用的是12个道的窄梳子,做细胞可以,但是组织就弥散的更厉害。请各位高手帮帮忙,谢谢啊!!
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请问在western中不同细胞的内参beta tublin是否有表达差异?
我做的是大肠肿瘤中不同细胞的蛋白表达,蛋白都反复重提了好多次,今天用新蛋白做的western还是内参不齐,我用的是beta tublin,且发现总是有一个特定的细胞株内参表达特高,是不是在不同细胞中内参的表达不一样呢?蛋白的提取应该是没有问题的,我的标准曲线也是很直的啊
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谢谢楼主的分享,我在做一个蛋白,但问题是内参b-actin都做不出来,请问你是用的谁家的一抗和二抗呢?稀释比例是多少?
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zhenxin[使用道具]
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楼主你太好了,我正好现在做17KD的目的蛋白,从你那里可以借鉴下了,很是感谢!不过我提取蛋白后不测浓度,直接加统一的上样量!这样很有影响吧,我的内参条带不是一样呀呵呵还有上样缓冲溶液里面的巯基乙醇必须现用现加吗?
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redbutterfly[使用道具]
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1.楼主做的17KD的蛋白,为什么转移液不加SDS,如果加了会有什么后果?
2.我做的也是17KD,用0.45的膜,转不上后来才知道要用0.22的膜,可是做了几次,转移的效果都不好,MARKER很难转到膜上?用0.45的膜转30分钟膜已经很漂亮了,0.22的膜转40分钟膜上依稀可见MARKER的条带,胶上的条带却很清楚?
我很着急,做了2个月了,只有内参能够曝出来。木的条带从来没出来过。
恳请楼主多多指教!!
多谢!
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