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标题:【求助】免疫沉淀沉淀不完全

莓菓333[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

珠子是santa的，protein A/G plus-agarose immunoprecipitation reagent （sc2003）。裂解液用的RIPA，配方是50mMTris(pH7.4),150mMNaCl，1%NP40，0.1%SDS，说明书上说特别适用于免疫共沉淀。麻烦大家帮我看看有没有不妥的地方？
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发表于 2013-7-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS may influence protein bind onto antibody in some cases, it is why I suggest you delet SDS in cell lyses buffer.
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发表于 2013-7-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！我明白了，下次用不含SDS的裂解液试试。是不是只要不含SDS就行啊？Triton和NP40都行吗？
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发表于 2013-7-3 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Yes. The CHAPS is better but it is very expensive.
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发表于 2013-7-3 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还想再问下：IP后洗涤是否也用同样的裂解液？为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？谢谢
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发表于 2013-7-3 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

A.IP后洗涤是否也用同样的裂解液？
Yes.

B. 为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？
1. Washing beads gently.
2. Add glycerol to final 5% if necessary, it can make protein stable in some cases.
3. Add phosphase inhibitors if the PPI may relate to the statuse of protein phosphrylation.

Good luck!
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 小中大
BOSS兄，另外清洗珠子时用的离心条件是怎样的呢？2000r，3min行吗？
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发表于 2013-7-3 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Yes. 2000rpm x 3min or 3000rpm x 2 min are OK.
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发表于 2013-7-3 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近用非变性裂解液又做了一次，HSP90大部分都沉淀下来了，但是杂AKT，看到的结合量还是很少，请大家帮我想想还有什么地方有可能破坏了蛋白之间的相互结合？比如清洗珠子的时候能不能不用裂解液，用PBS可以吗？我觉得这样比较温和。谢谢了！
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发表于 2013-7-3 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，我还想问一下：coIP阴性对照是怎么设的？我们实验室没有正常的IgG,应该用什么设阴性对照呢？是不是应该设一个只加珠子不加抗体的对照啊？来证明珠子不会将蛋白沉下来。
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