小中大兄台可能纯化任务繁忙,只做纯化后的蛋白电泳,我是纯化全过程都用电泳检测的,包括诱导前后的全菌样品。
超声确实有时候会引起大肠杆菌表达的重组蛋白断裂,我在“蛋白质纯化武器-工艺篇”中也曾提到和分析过。但那和本贴中的GST融合蛋白断裂情况不一样。
“工艺篇”中提到的那种断裂是在超声过程中产生的,不超声的表达菌做电泳没有断裂情况。而GST融合蛋白的断裂在破菌之前就产生了,换而言之,在大肠杆菌表达后的胞内就有部分断裂。
这种断裂与是否包涵体表达无关。我所纯化的一个GST融合蛋白是可溶上清表达的,也有断裂条带存在。我的断裂带与目标带的比例在这个例子中大约为3比7,但这个比例是可变的,另外一种表达蛋白的这个比例要少得多。
综合一下目前的推测:
1、重组工程菌诱导后先表达全长的GST融合蛋白;
2、部分全长的GST融合蛋白在表达后被大肠杆菌自身所切断,而这种切断与目标蛋白是否可溶表达无关;
3、这种切断应该是在表达后的短时间内就发生了,很可能是在转运之前发生的。因为诱导时间的长短与这种断裂的比例从电泳上看无明显差异。如果断裂的过程在菌体内一直都在进行的话,就会有诱导时间越长,断裂条带比例越高的现象。
4、宿主菌无论表达何种外源蛋白,单个多肽链表达好后都是可溶的。宿主对不同GST融合蛋白的攻击效果不一样,有着不同的动力学。蛋白被转运后,攻击就停止了。这时,融合蛋白或成可溶状态,或聚集形成包涵体。
5、宿主菌对空载体表达的GST蛋白攻击无效果,可能与蛋白的本身结构和大小相关。融合表达的GST蛋白也是攻击效果不同的。
6、攻击断裂是从N端开始的,会造成N端的GST蛋白与GST亲和柱的结合产生障碍。不知道有没有熟悉GST蛋白酶和底物关系的战友来验证一下,是不是GST蛋白缺失N端10KD片段后,酶与底物的结合就非常困难了。
信手所写,大家讨论讨论。