小中大－20度沉淀10min后，用70％乙醇洗涤，晾干后加入适量适量双蒸水溶解
3．Pcr验证
DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP（2.5mM） 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图：
490bp
酶切验证：ddH2O 6ul
10×buffer 2ul
BSA 2ul
BglⅡ 1ul
NotⅠ 1ul
质粒 8ul
20ul体系
结果见图：
Pcr验证和酶切验证结果表明提取的质粒为重组质粒pPIC9K/VEGEF，可以大规模抽提质粒，供电转化酵母。
内容二：VEGF表达菌珠的筛选
1，大规模抽提验证成功的重组质粒（100ml菌液，方法同上）
2，重组质粒的线性化：
pPIC9K重组质粒 44ul
SalⅠ 1ul
10×buffer 5ul
50ul体系
37度酶切2h，65度灭活20min，1％琼脂糖电泳，检测。第一次用DNA回收试剂盒回收凝胶，但是回收率太低，因此线性化后直接考虑用1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀。加少量水溶解，取1ul检测。
3，制备酵母感受态：（1）挑菌于5mlYPD培养液中30度培养过夜。
（2）取0.1－0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养液中培养过夜，OD600＝1.3-1.5。
（3）离心，1500g，5min，4度。用500ml冰冷无菌水重悬菌体。
（4）离心，然后用250ml冰冷无菌水重悬。
（5）离心，然后用20ml冰冷山梨醇（1M）重悬。
（6）离心，用1ml冰冷山梨醇重悬。每管100ul分装于1mlep管中，－80度保存。
4，电打孔法转化酵母
把BIO-RADE电打孔仪调好个参数（电压1500v，电阻：200Ω，电容25uF），将线性化重组质粒15ul加入制备好的100ul酵母感受态细胞中，混匀，冰上预冷5min，转入0.2cm电打孔杯（预先放冰上预冷）中，置于冰上10min，放入电打孔仪，电击后取出，迅速放回冰上并加入1ml预冷1M山梨醇中，混匀，置于30度摇床震摇40min，吸取300ul涂布于MD平板上，30度培养2天。
5，阳性平板高拷贝克隆筛选
将MD平板上长出的His＋克隆，用3mlYPD培养液冲洗后，用涂棒涂匀，吸取菌苔液于1.5mlep管中，测定OD值为3.7。1OD＝5×107cells/ml，3.7OD＝1.85×108cells/ml，一般涂布浓度为105/200ul,因此稀释100倍。取200ul涂布于不同浓度梯度的YPD－G418平板上（浓度依次为：0.25,0.5,2.0,4.0,8.0mg/ml）。30度培养两天。
6，mut＋基因型的筛选
将在4.0,8.0mg/ml长出的高拷贝克隆，先点在MM平板上，再点在MD平板上，培养，观察两个平板上的生长情况。可是发现在MM平板上长的比MD平板上慢，以为时muts型了，但觉得这种方法来筛选mut＋不可靠，因此又决定用pcr验证来筛选。
步骤一：酵母基因组DNA的提取
取1ml菌液，离心弃上清，用100ul水清洗沉淀，加入100ulTE重悬，再加入10ul 5U/ul的zymolyase，30度作用30min，加入1ml酵母裂解液（100mmol/L，10mmol/LTris.HCl，25mmol/LEDTA，0.5%W/VSDS,蛋白酶k终浓度0.1mg/ml）65度水浴使其充分消化，加入等体积酚：氯仿（1：1），高速震荡3min，离心，收集上清，加入1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀,离心，70％乙醇洗涤，晾干后，收集沉淀，20ulddH2O溶解。
步骤2：用VEGF基因引物和AOX1基因引物分别进行pcr验证。
PCR1： H2O 12ul
10×buffer 2ul
DNTP 2ul
5’AOX1 1ul
3’AOX1 1ul
酵母基因组 1ul
rTaq 1ul
20ul体系
94度1min
94度2min 55度 1min ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
