小中大-20度沉淀10min后,用70%乙醇洗涤,晾干后加入适量适量双蒸水溶解
3.Pcr验证
DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP(2.5mM) 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图:
490bp
酶切验证:ddH2O 6ul
10×buffer 2ul
BSA 2ul
BglⅡ 1ul
NotⅠ 1ul
质粒 8ul
20ul体系
结果见图:
Pcr验证和酶切验证结果表明提取的质粒为重组质粒pPIC9K/VEGEF,可以大规模抽提质粒,供电转化酵母。
内容二:VEGF表达菌珠的筛选
1,大规模抽提验证成功的重组质粒(100ml菌液,方法同上)
2,重组质粒的线性化:
pPIC9K重组质粒 44ul
SalⅠ 1ul
10×buffer 5ul
50ul体系
37度酶切2h,65度灭活20min,1%琼脂糖电泳,检测。第一次用DNA回收试剂盒回收凝胶,但是回收率太低,因此线性化后直接考虑用1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀。加少量水溶解,取1ul检测。
3,制备酵母感受态:(1)挑菌于5mlYPD培养液中30度培养过夜。
(2)取0.1-0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养液中培养过夜,OD600=1.3-1.5。
(3)离心,1500g,5min,4度。用500ml冰冷无菌水重悬菌体。
(4)离心,然后用250ml冰冷无菌水重悬。
(5)离心,然后用20ml冰冷山梨醇(1M)重悬。
(6)离心,用1ml冰冷山梨醇重悬。每管100ul分装于1mlep管中,-80度保存。
4,电打孔法转化酵母
把BIO-RADE电打孔仪调好个参数(电压1500v,电阻:200Ω,电容25uF),将线性化重组质粒15ul加入制备好的100ul酵母感受态细胞中,混匀,冰上预冷5min,转入0.2cm电打孔杯(预先放冰上预冷)中,置于冰上10min,放入电打孔仪,电击后取出,迅速放回冰上并加入1ml预冷1M山梨醇中,混匀,置于30度摇床震摇40min,吸取300ul涂布于MD平板上,30度培养2天。
5,阳性平板高拷贝克隆筛选
将MD平板上长出的His+克隆,用3mlYPD培养液冲洗后,用涂棒涂匀,吸取菌苔液于1.5mlep管中,测定OD值为3.7。1OD=5×107cells/ml,3.7OD=1.85×108cells/ml,一般涂布浓度为105/200ul,因此稀释100倍。取200ul涂布于不同浓度梯度的YPD-G418平板上(浓度依次为:0.25,0.5,2.0,4.0,8.0mg/ml)。30度培养两天。
6,mut+基因型的筛选
将在4.0,8.0mg/ml长出的高拷贝克隆,先点在MM平板上,再点在MD平板上,培养,观察两个平板上的生长情况。可是发现在MM平板上长的比MD平板上慢,以为时muts型了,但觉得这种方法来筛选mut+不可靠,因此又决定用pcr验证来筛选。
步骤一:酵母基因组DNA的提取
取1ml菌液,离心弃上清,用100ul水清洗沉淀,加入100ulTE重悬,再加入10ul 5U/ul的zymolyase,30度作用30min,加入1ml酵母裂解液(100mmol/L,10mmol/LTris.HCl,25mmol/LEDTA,0.5%W/VSDS,蛋白酶k终浓度0.1mg/ml)65度水浴使其充分消化,加入等体积酚:氯仿(1:1),高速震荡3min,离心,收集上清,加入1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀,离心,70%乙醇洗涤,晾干后,收集沉淀,20ulddH2O溶解。
步骤2:用VEGF基因引物和AOX1基因引物分别进行pcr验证。
PCR1: H2O 12ul
10×buffer 2ul
DNTP 2ul
5’AOX1 1ul
3’AOX1 1ul
酵母基因组 1ul
rTaq 1ul
20ul体系
94度1min
94度2min 55度 1min ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min