小中大细胞培养常见问题、可能原因及解决方法
问题1：培养液pH 值变化太快
可能原因
(1)CO2 张力不对
(2)培养瓶盖拧得太紧
(3)NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足
(4)培养液中盐浓度不正确
(5)细菌、酵母或真菌污染
建议解决方法
(1)按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5% 到10%。
(2)松开瓶盖1/4 圈。
(3)改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
(4)在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变
可能原因
(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来
(2)冰冻保存培养液
建议解决方法
(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀， 同时pH 发生变化
可能原因
细菌或真菌污染
建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁
可能原因
(1)胰蛋白酶消化过度
(2)支原体污染
(3)培养瓶瓶底不干净
(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)
(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当
(6)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)
(7)接种细胞起始浓度太低或太高
建议解决方法
(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶
(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)
(5)重新配置消化液或培养液
(6)启用新的保种细胞
(7)调节最佳接种细胞浓度
问题5：悬浮细胞成簇
可能原因
(1)培养液中含钙、镁离子
(2)支原体污染
(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释
(4)DNA污染
建议解决方法
(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
(2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)用DNase I 处理细胞。
问题6：原代细胞培养物污染
可能原因
原代培养组织在进入培养前已污染
建议解决方法
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
问题7：培养细胞生长减慢
可能原因
(1)由于更换不同培养液或血清
(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
(3)培养物中有少量细菌或真菌污染
(4)试剂保存不当
(5)接种细胞起始浓度太低
(6)细胞已老化
(7)支原体污染
建议解决方法
(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。
(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。
(4)血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2 周内用完。
(5)增加接种细胞起始浓度。
(6)换用新的保种细胞。
(7)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
问题8：培养细胞死亡
可能原因
(1)培养箱内无CO2
(2)培养箱内温度波动太大
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤
(4)培养液渗透压不正确
(5)培养液种有毒代谢产物堆积
(6)更多原因参考问题4和问题7
建议解决方法
(1)检测培养箱内CO2
(2)检查培养箱内温度
(3)取新的保存细胞种
(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
(5)换入新鲜培养液
(6)更多解决方法参考问题4和问题7
