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标题:【讨论帖】朊病毒

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我们已经对朊病毒有了一个大概的了解,作为唯一的蛋白质病毒(so far),它给蛋白版带来了这么好的话题。下面,想提一篇文章,关于朊病毒复制机理的文章,欢迎大家共同读一下,有心得可以写在这里,有问题可以提出来,我们共同学习,在讨论中共同进步。

文章来源:Nature 2003 Oct, vol 425, page 717-720

题目:RNA molecules stimulate prion protein conversion

文章简要介绍:我们前面提到过朊病毒非致病性到致病性的转变。这篇文章要证明的假设是,这种构象转变需要RNA分子的存在(in vitro)

大家都有过读文章和写文章的经历,一篇学术文章,首先要有假设(hypothesis),然后在文章中设计实验来证明这个假设,再从所得到的实验结果得到最终的结论(conclusion)。一篇文章是否严密,首先要看所设计的实验能否验证这个假设,第二个重要的步骤就是,从所得到的实验结果,能否推出文章最后的结论。

应该承认的是 nature 上的文章因为篇幅所限,有些步骤分得不是很清楚。我们暂以这篇文章为例,读一读关于朊病毒的进展,同时来找一下文章的假设、实验和结论都是什么,每一个环节都是否严密。文章能发在 nature 上,它九成会是篇好文章,但不排除被我们挑出瑕点的可能,我们一起来试一下!
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正常朊蛋白的可能功能

PrPc是一种膜糖蛋白,通过GPI锚定于细胞膜。其代谢周期从内质网开始。GPI锚和甘露糖聚糖在那里迅速附着于PrPC,再运送至高尔基体,在该处它们的N-寡糖被修饰并唾液酸化。然后,由分泌小泡运送至细胞外,以GPI锚固定于细胞表面,以磷酸脂酶或蛋白酶处理能将其除去。PrPc正常的半衰期只有3-6小时。它似乎是通过内陷(caveoae)重新进入细胞内降解。其正常功能目前还不明确,可能的功能是:铜结合蛋白;PrPc的表达可能对GABA(γ-氨基丁酸)的受体功能是必需的,通过细胞的信号转导来影响受体的功能;PrPc通过与电压敏感的钙通道相互作用,从而与细胞内钙的调节有关;PrPc可能在细胞上长期存在,起调节突触功能的重要作用。PrPc通过与GABA系统的相互作用而影响昼夜节律;PrP可影响长期记忆;还可能参与淋巴细胞活化[4,15,16,17] (图2-2)。

抗PrPSc形成的研究 (请问这一部分是不是指朊病毒蛋白从正常型到异常型需要X蛋白的作用?为什么取名X蛋白呢,不知对X蛋白的研究是否有什么进展。在这里如果把X蛋白理解为“蛋白折叠的分子伴侣”,不知是否合适?)

  人们未能分离出X蛋白,但已找到确切证据证明其在PrPSc形成中的作用[12]。替换PrPc 214~218位残基会阻止PrPSc的形成。绵羊171位氨基酸残基突变成Arg以后,表现出明显的TSE抗性。167和171位氨基酸残基突变后,也有类似结果[1]。此结论似乎可以反证“氨基酸残基95~170的区域,形成PrPSc与PrPc结合的界面,在残基165~171位组成内环,为X蛋白结合位点”这一推测的合理性。基因突变可以干扰PrPSc与PrPc的结合及X蛋白的作用。

朊病毒作用于细胞的可能机制
  朊病毒作用于细胞的可能机制主要是自由基学说。1996年Brown等证实人工合成的人类朊蛋白第106~126位氨基酸残基序列对表达PrPc的神经细胞有毒性作用,对正常的星形胶质细胞或PrPc缺失的小胶质细胞则无毒性[13]。机制是此段多肽提高细胞内氧化自由基浓度,而致使神经元凋亡[7,8,9]。朊蛋白的神经毒性作用基团主要集中于106~126位氨基酸多肽链区域[9,10]。实验表明由PrPc106~126诱导的细胞死亡可归因于凋亡,细胞的凋亡程度依赖于PrPc106~126的浓度[3]。PrP蛋白N-末端的无规卷曲区域可能不直接参与致病过程。
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PRP,非常感谢你的这篇综述,觉得写得很不错,和我们要讨论的话题十分贴近。可是后面几个图,三级结构和构象转变的,看不到。是我电脑的事还是图没有附上?如果手头还有,可否贴上来让大家看一看?

下面这张图是PRP综述里的图一,朊病毒蛋白的二级结构图:


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prp 三级结构


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PrPc向PrPSc转中X蛋白作用模式图。
在此做一下说明,图中的protein X 就是在前文提过的蛋白X,是指导alpha 螺旋为主导的正常朊病毒蛋白变为beta 折叠为主导的异常朊病毒蛋白(致病蛋白)的分子伴侣。刚查了一下,对X蛋白的研究现在还没有更多进展,只知道它是一个分子伴侣。[icesugar75 注]


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这张是具有感染性的朊病毒蛋白的结构图,注意是以折叠为主:


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不知大家有没有时间读一下上面推荐的 nature 上关于 “prion 复制需要小分子RNA的参与” 这篇文章?

文章一点不难,而且要证明的事情很简单:具有感染性的朊病毒蛋白在复制时需要RNA分子的参与。

1。用不用全文翻译?
2。是译为主还是讨论实验方法为主?
3。有多少朋友能参与讨论?大家能投入多少时间?(我可以帮忙找背景材料,如果参与讨论的朋友不懂哪一步可以提出来,我不行还有别人行呢)
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相关疾病:
感染
文章来源:Nature 2003 Oct, vol 425, page 717-720

题目:RNA molecules stimulate prion protein conversion

先把我上面的问题 hang on 着,欢迎大家在文章讨论的同时随时提出宝贵意见,您的参与是对我最大的支持和鼓励!一篇文章的讨论并不是最重要的,最重要的是想通过这种形式,来帮助大家学会怎么阅读论文,怎样通过阅读别人的文章来build up 自己的科研思维。(也许话说得大了些,大体上是这个意思吧)

下面我就简单介绍一下这篇文章的内容。

文章的假设直接指向:具有感染性的朊病毒的复制需要小分子特异性RNA的参与

文章所用条件:体外

(对体外模型当然有不周到的地方,对此,在文章介绍中第一句就提到:We previously showed that PrPres amplification in vitro shares many specific features with the pathogenic process of prion propagation in vivo, including strain and species specificity. 这里还特意指明了,研究结果表明不同种属来源的朊病毒和朊病毒的不同strain 性质相似。附件的图版是不同鼠体内朊病毒的构象相似状况,请看一下)

主要实验技术:跑胶(蛋白胶和核酸胶)

(方法十分简单,这也验证了一些说法:NATURE或SCIENCE上的文章,实验方法可以很普通,主要在创意。如果我们中的谁想到了一个好主意,只加了加热,也一样可以发在NATURE,SCIENCE 上)

请大家注意一下:这篇文章主要讨论的是有感染性的朊病毒的复制过程,而上面我们讨论过的更多是关于无感染性朊病毒到有感染性的“构象转变”,所以请不要混淆了。

文章based on 的一些理论依据是:有感染能力的朊病毒的复制不需要核酸(一些实验证据表明的);构象翻转机制现在还不清楚。

文章的思路:被朊病毒感染的Hamster (一种大鼠,仓鼠?)的脑匀浆与健脑匀浆混合,三十七度过夜,测具有感染性的朊病毒蛋白的增殖(diluted prion-infected brain homogenate (0.1% w/v) is mixed with either 5% (w/v) normal brain homogenate or buffer control and incubated overnight at 37 oC. Hamster Sc237 PrPres is amplified about sixfold under these conditions );为了证明不是蛋白酶、核酸酶、双链小RNA、DNA与RNA杂交体、单核苷酸的作用,分别把它们的抑制剂或降解试剂加入,再跑胶,看是否对复制有影响

文章结论:

-- 有感染性朊病毒体外复制需要特异性小RNA分子的参与

-- 哺乳动物RNA有作用,而非脊椎动物的RNA不行

-- 有感染性病毒的复制过程中,宿主的RNA可能参与了构象翻转

文章有很多疑点,希望大家按着这个思路读一下,我们一起讨论一下这篇文章。时间很多,我们可以讨论一个月,两个月。文章讨论时贵精不贵多,有了思路和方法以后就好读多了。
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相关疾病:
感染
这是来自不同物种:mouse, hamster 的朊病毒的构象(从多螺旋结构看来应该是不具感染能力的),很相象。


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Benzonase

<enzyme> Product of genetic engineering which hydrolyzes both DNA and RNA; from serratia marcescens(粘质沙雷氏菌);both Dnase and Rnase activity.
Synonym: benzon nuclease, ben endonuclease
Benzonase® - The smart solution for DNA removal
For the first time, an effective biochemical method is available for removing DNA and RNA from laboratory and industrial scale bioprocesses. It is called Benzonase® endonuclease.
Benzonase® is a unique, genetically engineered endonuclease offering a variety of advantages over existing methods of nucleic acid removal.
Benzonase® endonuclease has proven its value in the laboratory for well over ten years and is successfully applied in the pharmaceutical and biotechnological industry in the downstream processing of biopharmaceutical actives e.g. monoclonal antibodies, virus vaccines, gene therapy and recombinant proteins from E.coli.

Benzonase® is applied whenever the presence of nucleic acids might cause interference i.e.

• Purification and characterisation of proteins, and peptides
• Purification of antibodies and viruses for therapeutic use
• Safety of biopharmaceuticals

FDA guidelines for the manufacture of recombinant biological entities for therapeutic use demand that nucleic acid contamination should be limited to 10 pg per dose. Benzonase® - alone or in combination with other steps - offers a powerful and well-accepted tool to achieve regulatory requirements.
Benzonase® is covered by several patents, i.e. US Patent No.5,173,418, EP Patent No.0229866 B1
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