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标题:【讨论帖】朊病毒

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-19 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第二个问题：micrococcal nuclease 是什么酶，作用特点？

既是第二个问题，加一点点难度：除了用英文，用部分中文解释一下。

问题提示：同第 1 题，文章中没有，可查资料回答。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-7-19 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
起源 : Staphylococcus aureus菌体的培养液
概述
Micrococcal Nuclease-------微球菌核酸酶(MNase)是一种内切核酸酶，作用于单链及双链核酸[包括DNA 和RNA <icesugar75注>]，生成3'磷酸末端。对单链核酸的作用较好，能较好地分解DNA或RNA的富含AT或AU区域。本酶不需要Mg2+,其催化作用需要Ca2+的存在。

活性定义: 以热变性小牛胸腺DNA作底物，在37℃，pH8.0的条件下，30分钟内生成1 OD260的酸可溶性物质的酶的活性定义为1 U。
纯度 50 U的本酶和1 μg的λ-DNA在Mg2+存在下37℃反应10分钟，DNA的电泳谱带不发生变化 .SDS电泳表现95%以上的纯度。
使用注意 : 本酶的活性严格依赖于Ca2+的存在，用EDTA或EGTA可以终止反应。
用途: 细胞粗抽提液中核酸的水解。
为制备核小体 (Nucleosome) 时消化分解染色质 (Chromatin)
参考资料：
Pelham, H. R. and Jackson, R. J., Eur. J. Biochem. 67, 247 (1976).
Noll, M., Nature 251, 249 (1974).
Heins, J. N. et al., Proc. Nucl. Acids Res. 1, 79 (1976).

Ye, X. et al. Defective S phase chromatin assembly causes DNA damage, activation of the S phase checkpoint, and S phase arrest. Mol. Cell 11, 341-351 (2003) | PubMed |

Mujun Zhao*, Zhenyu Wu, Wenlin Chen, Tsaiping Li:“The Biological Significance of Micrococcal Nuclease (MNase) hypersensitive sites of rRNA chromatin template of Silkworm Attacus ricini”， Molecolar Biology of the Cell. Vol.10, (Sup) pp.282a, 1999
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-7-19 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Benzonase is a genetically engineered endonuclease which degrades both DNA and RNA strands in many forms to small oligonucleotides. It promotes quick reduction of the viscosity of cell lysates, which facilitates ultracentrifugation and increases the capacity and life of chromatography columns. It saves time, reducing proteolysis and increasing the yield in targeted protein and offers complete elimination of nucleic acids from recombinant proteins.
来源:cuturl('http://www.oswel.com/code/en/mod_38.htm')
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发表于 2013-7-19 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我注意到这篇文章不是以article而是以letter形式刊登的，所以觉得Nature的编辑还是相当慎重的。蛋白质折叠的问题是中心法则的最后堡垒。现在如果能弄清楚新生肽如何折叠，无疑将是最的重大突破。但是我们研究蛋白质时，大多是进行的体外实验，当然这符合先把问题简单化然后再把问题复杂化的顺序，可体内和体外的差别很大，如我以前发的一个帖说生物大分子的拥挤环境对蛋白质的影响一样，现在人们对体内生物大分子环境如何影响蛋白质的折叠越来越关心。所以，PrP如何完成折叠，体外和体内还是有些区别，特别是要考虑到体内免疫系统的参与，考虑到体内生物大分子拥挤环境的参与，也许确实需要小分子RNA，更有可能的RNA的背后还藏有别的分子，就合DNA的复制、转录一样，除了核酸外，有为数众多的小分子参与。

附：一些关于蛋白质折叠的观点
在试管中做蛋白质折叠实验的条件往往人为简化或不得不简化，与新生肽在细胞内折叠的条件有质的或量的差别。所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子，它们大约占用细胞容积的20－30％，总浓度高达每升80－200克，因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的“拥挤”环境中，使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少，这种情况对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很大的影响。最近，有人呼吁，在体外研究蛋白质折叠必须考虑模拟细胞内的“拥挤”环境。此外，某一种蛋白在某一时刻在细胞内的局部浓度可以非常高，这样高浓度的蛋白质在试管中必然发生聚集而不可能完成折叠。所以，在体外进行的实验，为了提高蛋白折叠效率，并且有利于进行分析，实验所用的蛋白浓度总是很低的；温度也常在37摄氏度以下，有时低到10摄氏度以下，以减缓反应速度。溶液成分也尽量简单，便于分析。
1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-19 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第 3 个问题：再加些难度

讲一下 RNase A, RNase T1, RNase V1, RNase H 的作用特点，包括相同点和不同点。

问题提示：都是RNase, 都可降解 RNA，具体能降解何种形式的 RNA 呢？单链的，双链的，还是长的，短的？降解产物是长的，短的，还是有什么末端特征的？-- 文章中只有星点线索，推荐网上查找资料。
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发表于 2013-7-19 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RNase H: 起源
Escherichia coli HB101 containing E. coli rnh plasmid (pKH11) and regulator plasmid (pNT203)
概述
RNase H是特异性分解RNA-DNA杂交体中的RNA链的核糖核酸内切酶，产生具有游离3'-OH和5'-磷酸末端的产物，该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。
一般性质 分子量 21,000 最适pH pH8.0附近 活化剂 Mg2+或Mn2+
活性定义 以Poly(rA)·Poly(dT)为底物，在30℃、pH7.7的条件下，20分钟内产生1 nmol酸可溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位 (U)。
用途 :
通过Okayama-Berg法进行cDNA Cloning。
DNA-RNA杂交体的检定。
在Oligo(dT) 存在下除去mRNA的Poly(A) 末端。
mRNA的定量。

Remove RNAs. For isolate highly pure plasmids ideal for transfection or automated sequencing

RNase A, Bovine Pancreas
核糖核酸酶A(牛胰)
概述：
核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二脂键。反应终产物是嘧啶3'磷酸及末端带嘧啶3'磷酸的寡核苷酸。
来源：牛胰。
DNase活性去除：
将固体RNaseA溶于10mM Tris-HCl，pH7.5，15mM NaCl缓冲液或灭菌水中，在100℃煮沸15min后在室温缓慢冷却。
应用：
1. 从DNA：RNA杂交体中除去杂交的RNA区。

RNase Cleavage Site
A 3' of ss C's and U's
V1 base-paired nucleotides

从这里进入可以找到RNase A或 V1 的许多相关作用介绍
cuturl('http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?2275')
cuturl('http://www.ambion.com/techlib/tn/92/9214.html') [icesugar75 添加]

RNase A cleaves 3' of single-stranded C and U residues. RNase V1 cleaves base-paired nucleotides

Ribonuclease T1 (RNase T1) is an endoribonuclease that specifically cuts RNA or deaminated RNA at the 3’-end of guanosine residues and adjacent nucleotides through a 2’, 3’-cyclic phosphate intermediate mechanism. Epicentre’s RNase T1 is cloned from Aspergillus oryzae and over expressed in E. coli to produce a highly pure enzyme without contaminating DNase or non-specific RNase activity. [icesugar75 补充]

这是一个例子（附件中）：Structural Analysis of an RNA.
The RNA molecule shown above was end-labeled and subjected to digestion with RNases A, TI, and VI. The resulting fragments were visualized by denaturing PAGE.


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 小中大
下面来小结一下：

为了让大家充分理解文章中第一个figure 的意义，我们已经做了不少准备工作。首先就是关于不同类型的 RNase。因为文章要研究的是RNA与prion 复制的关系，所以什么样的RNA，单链双链，长链短链，与结果息息相关。

研究RNA二级结构的酶主要用了RNase H，RNase V1, RNase T1. 这几种酶作用特点各有不同，milkmoon 的介绍非常详尽，有一个小小的图表传上来，希望有利于大家查看：

RNase H 特异性分解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA，对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。


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发表于 2013-7-19 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好了，我们做了这么多准备，现在来看看文章的第一个图做了些什么实验：

图1A：用RNase (DNase-free); RNase A; RNase T1; Micrococcal Nuclease; Benzonase 分别加入复制反应体系中，观察这些酶的加入，对有感染性朊病毒蛋白复制的影响。酶是不同稀释度的。

Note for your convenience:

--- RNase A: 降解 DNA 和 RNA 杂交产物中的RNA
--- RNase T1: 降解 RNA
--- Micrococcal nuclease: 同时水解DNA 和 RNA （无论单双链）
--- Nenzonase: 同时水解DNA 和 RNA （无论单双链）

注意：
1。方法是蛋白跑胶做 Western Blot
2。第一行中所使用的 RNase 种类没有提及；

从图1A中可以看出文中给出的结论：prion 的复制是不依赖DNA 而是RNA的，而且是 RNase 剂量依赖的。

现在提出第 4 个过关问题：

既然文章用 western blot 做蛋白质定量，从图1a 看来，它缺少了哪一个重要的对照？


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 小中大

相关疾病：
感染
主任都引导到这里了，随便说说： 是不是缺少DNase作用后的一组结果！不过或许思维有误！[不是思维有误，这部分实验在图1b 呢。icesugar75 注]

“都怕别人以为跟你是一伙儿的了” 莫怕，莫怕！我只是为了学习，在你提出问题之前我还没有太多的考虑，这样可以增加认识，但是提出问题是更可贵的，因为你已有了答案。。。。。。[我哪里的答案，一起讨论嘛，icesugar75 注]

另外提一下“分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质”对这个不应该提出太大的疑问，如果这个显然的问题没得到大家在很多未知的前提下的一种默许的话，这篇文章未免。。。。。。[没见这方面的材料啊，很难讲的。 icesugar75 注]

我随便浏览了一下，捏来一点：

海绵状脑病 本病为一组疾病，其共同特点是脑灰质疏松呈海绵状，其中亚急性海绵状脑病和Kuru病可见于人类和灵长类。此类疾病的病原体为小分子量（60000）的糖蛋白称为Prion(Pr)。Pr是正常神经元的膜蛋白，本身并不致病。如其结构发生一个氨基酸的变异，形成Pr5C则不能被蛋白酶完全降解，形成Pr27-30。后者形成类淀粉蓄积于神经元胞体内，造成神经元死亡。Pr27-30感染（接种）于另一个体可起模板作用，进行大量复制，造成疾病蔓延。Kuru病仅发生在大洋洲巴布亚新几内亚，由于食人尸脑而传播。革除陋习后此病几乎已绝迹。

Priori的微生物学特征

　　一、理化性质；Prion具有非常的理化特性，能使核酸失活的物理方法(如煮沸、紫外线照射、电离辐射等)和化学方法(如核酸酶、羟胺、锌离子作用)对其均无影响，Prion感染后的提纯制备物亦测不到核酸，但许多蛋白质变性剂可使其感染性不可逆地失活。因此，Prion是一种缺乏核酸的蛋白质因子。

　　二、生物学特性；Prion是一分子量为33kD～ 35kD的糖蛋白，Prion蛋白(prion protein，Prp)由 254个氨基酸组成(人类Prp为253个氨基酸)。研究发现，Prp存在异构体，既Prpc和Prpsc。Prpc是存在于正常组织的功能还不清楚的糖蛋白，对蛋白酶敏感，不致病，Prpsc分子量为27kD一30kD，对蛋白酶有抗性，是可致病蛋白质。在正常脑组织中只有Prpc，没有Prpsc，而患病大脑中则既有Prpc，又有Prpsc。尽管这两种Prp的氨基酸序列相同，但其立体构象却不一致。Prpcα螺旋高达42％，β片层仅 3％，而Prpsc却相反，α螺旋仅3％，而β片层则高达43％。这种构象的差异导致了化学性质和生物学作用的明显不同。Prion不含核酸，它如何复制，现尚无定论。

　　三、分子生物学：不论动物抑或人类，Prion由宿主染色体上一个单拷贝基因编码，人Prion基因 (PRNP)位于20号染色体的短臂上，小鼠Prion基因则位于2号染色体上。人PRNP的突变常发生在第32、48、56、72位密码子处，多为重复片段的插入或点突变，突变的结果是使Prpc分子转变成Prpsc。

　　Prion的传染性与遗传性
　　Prion不仅有传染性，而且有遗传性。（临床内科杂志，4：169；1999）
cuturl('http://www.xssc.ac.cn/discussion')
cuturl('http://medicine.bjmu.edu.cn/department/biophysi/biophysics/LAB/NewSNL/training%20course/reviews/TSE97review.pdf/applydetail.asp?rno=505&cla=C0')
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发表于 2013-7-19 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
牛海绵状脑病
谈一点PrPc的功能

Prion的编码基因为PRNP，编码PrPc和PrPsc两种蛋白质，两者构象不一，PrPsc为疯牛病的病原体。虽然大多数的文献一提到PrPc就说其功能还不明确，但实际上近年来对PrPc功能的研究还是有一些进展的，归纳如下：
1、PRNP基因敲除的小鼠出现异常的睡眠模式和电生理特性，并且对药物诱导的癫痫的敏感性增加；
2、PrPc能与Cu离子结合，能调节胞内Cu/Zn超氧化物歧化酶的功能，与细胞的氧化应激反应有关
3、PrPc能激活Lyn、Syk、Fyn等激酶继而进一步激活PKA、PKC、PYK2等下游分子
4、PrPc有抑制神经细胞凋亡的作用
5、目前已经鉴定了多种与PrPc相互作用的蛋白质，包括heparin-like compounds、 the neuronal phosphoprotein synapsin Ib、Grb2、 Pint1 、Laminin、stress-inducible protein 1等。
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